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现在的分子生物学研究主要是基于群体细胞试验,但生物分子在单细胞中的行为并不总是和群体细胞实验中表现出来的行为一致,抑癌蛋白p53就是一个明显的例子。在正常细胞中,p53被Mdm2蛋白结合并快速降解以保持低转录活性状态;当细胞受到电离辐射而导致DNA损伤时,p53蛋白迅速积累并激活,执行一系列的修复或凋亡相关的转录任务。群体细胞实验显示,DNA损伤时p53蛋白量表现为阻尼振荡,振荡随着DNA的修复愈来愈微弱,直至损伤修复,p53转录活性和蛋白量恢复低水平,振荡停止。但在单细胞分子荧光标记实验中,DNA损伤后p53是以数字振荡的形式表达的:p53蛋白量表现为一个脉冲、两个脉冲或更多脉冲,脉冲个数与损伤程度成正相关,而各个脉冲的形状大小并不变化;细胞可能正是通过p53数字振荡来决定生存还是凋亡。在极其复杂的p53基因网络中,这种数字振荡的分子相互作用机理并不清楚。大量实验研究结果表明:电离辐射时决定细胞内p53蛋白量的主要因子是ATM、Chk2和Mdm2这三个蛋白,由这四个蛋白构成了一个简化的p53基因网络图。以这个基因网络图为基础,我们构建了p53网络的数学模型,通过数值模拟分析了p53分子振荡中可能的分子相互作用机理。
Chk2通过寡聚化介导的顺式和反式自身磷酸化过程可以建立一个双稳态的自身激活开关,Chk2的激活是一个类似开关的行为,DNA损伤和Chk2浓度增加都可以打开这个开关。正常情况下,Chk2处于非磷酸化的非活性状态,当DNA损伤达到15个DSB时,Chk2突然激活,随着DNA损伤修复到只有5个DSB时,Chk2又突然关闭。Chk2可以在没有DNA损伤的情况下通过过量表达实现自身激活。模型模拟的这些结果和实验观测结果一致。
由于p53激活Mdm2过程中的协同效应和转录翻译过程中的时间延迟,Mdm2和p53之间形成的负反馈环可以产生持续的振荡,振荡周期为440min,峰的宽度为310min。Mdm2被ATM磷酸化并快速降解是持续振荡所必须的。这些与实验结果相吻合。另外我们发现,即使在电离辐射后的细胞中,转录活性的p53仍然只占总p53蛋白量的很少部分。 Chk2的开关行为可以在上游严格地控制p53信号的强度和持续时间。把p53上游的Chk2双稳态开关和p53持续振荡结合起来,自然而然地形成了p53的数字振荡。模拟结果显示:在DNA损伤系统中,p53蛋白量是一些离散的脉冲,p53脉冲的个数与DNA损伤程度成正相关,与DNA修复速度成负相关,但脉冲的形状与大小保持不变,并不依赖于DNA损伤强度,这些结果满足数字振荡的三个标准,因此,p53的振荡是数字振荡。p53脉冲的个数受DNA修复速度影响较大,而对DSB个数不敏感。p53数字振荡的分子作用机理是:p53和Mdm2通过负反馈环产生持续振荡,p53上游分子Chk2创造一个双稳态的开关,这个开关控制了p53和Mdm2负反馈环;当DNA损伤超过15个DSBs时,Chk2突然激活,同时打开p53与Mdm2的负反馈环,p53蛋白量开始持续振荡;随着DNA的修复,双链断裂位点数逐渐减少,但此时由于双稳态的迟滞现象,Chk2的活性保持不变,因此p53每个脉冲的形状和大小保持不变;随着修复的持续进行,当DNA损伤低于5个DSBs时,Chk2突然失活,立刻关闭p53和Mdm2之间的负反馈,p53振荡突然停止;如果DNA损伤太严重或难以修复,p53振荡的脉冲达到一定数量,诱导细胞凋亡。数字振荡的本质是双稳态的开关控制持续振荡。
P53的数字振荡可对其某些靶基因产生特殊影响。数字振荡的1p53可以诱导长半衰期的凋亡前期蛋白Bax以层级式的方式积累,p53脉冲愈多,Bax积累的愈多,最终Bax积累达到一定阈值诱导凋亡,如果p53脉冲少,Bax积累不到阈值,最终细胞得以幸存。“Bax Stairs”可能是p53决定细胞命运的方式之一。
本研究中的创新点在于:简化了复杂的p53基因网络并构建了新的p53基因网络的数学模型,通过数值模拟,我们提出Chk2这个重要的细胞周期检验点蛋白可能以双稳态的方式激活;阐明了p53数字振荡的分子作用机理可能是双稳态的Chk2严谨的控制p53和Mdm2之间持续振荡的结果,并给出了一种可以产生数字振荡的数学模型。这些结果为理解极其复杂的p53基因网络打开了一个窗口,为深入研究p53基因网络提供了可用的理论框架。