条斑紫菜(Pyropia/Porphyra yezoensis)病原学研究及琼胶降解菌筛选

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条斑紫菜(P. yezoensis)是红藻门的代表性物种之一,对其起源进化和环境胁迫适应机制等科学问题的关注,使其成为藻类模式物种之一,具有重要的科研价值。条斑紫菜自然分布于西北太平洋沿岸潮间带,是冬春季的优势物种之一,具有重要的生态价值。目前,条斑紫菜在中国、日本和韩国被大规模栽培,年产值达数十亿美元,具有重要的经济价值。但近年来,随着条斑紫菜栽培规模的持续扩大,病害发生的频率、规模和危害程度也逐年增加,对条斑紫菜病害进行病原学和致病条件的研究,不仅可以为制定病害防治措施提供依据,而且也将为抗病品系的筛选提供条件。本论文从分离紫菜病原菌,深入研究其致病原因以及各环境因子对病害发生的影响。绿斑病是条斑紫菜配子体幼体时期的常见病害。本论文通过分离、培养、回感确证了绿斑病病原菌,分子生物学及生理生化特征鉴定结果表明其病原为Pseudoalteromonas carrageenovora,该病原菌为革兰氏阴性杆菌,具有很高的蛋白酶活性和脂酶活性,此外多种芳胺酶反应为阳性。研究发现该病原菌致病性与环境因素相关,结果显示温度以及紫菜养殖密度对病情的蔓延影响较大,高温以及高密度养殖会加速绿斑病病情的发展,而海水比重在一定范围内变化不影响该病的发生。赤腐病是条斑紫菜生产最严重的病害之一。本研究以疑似感染赤腐病的条斑紫菜为材料,观察了病斑组织的细胞学和亚显微结构,通过分离、培养、回感确证了病原菌,并进行了分子生物学鉴定。观察发现,患病叶状体上可见大小不一的病斑,病斑中央部分呈浅绿色,周围红色,靠近未感染部位呈一圈鲜紫红色。光学显微镜观察,可见病斑处细胞已经失去正常细胞的形态而被菌丝串联在一起,此特征与赤腐病病症类似。对分离培养的病原菌进行ITS序列分析,结果显示该真菌为交链孢霉菌(Alternaria sp.),与典型赤腐病病原菌并不一致。藻类病原菌通常具有分解海藻胶的能力,本研究从不同海藻的腐烂材料以及海参肠道中分离纯化琼胶降解菌,开展了菌株鉴定、培养条件优化、产琼胶酶条件优化和琼胶酶基因克隆等研究。通过初筛、复筛共获得4株具有较高琼胶降解能力的细菌HD、JL、QJ和HS。相对粗酶活力测定结果显示,4株琼胶降解菌在2216E海水培养基中产酶状态最好,菌株产酶的最佳条件与最适生长条件一致,4株菌琼胶酶最大相对酶活力相近,且胞外酶活力远远大于胞内酶,一般在培养36h后酶活力达到最大。经鉴定,4株菌均为革兰氏阴性菌,呈杆状。16SrDNA序列分析显示菌株HD、JL和HS属于噬琼胶菌属Agarivorans sp.,而菌株QJ该基因序列与GenBank数据库中相关序列的同源性均低于95%,可能是一新属或新种。菌株HD、JL和HS都能克隆出长度为2868bp的β琼胶酶基因,而菌株QJ没有克隆出β琼胶酶基因。分离得到的琼胶降解菌一方面可用于测试其对藻类的致病能力,另一方面可生产琼胶酶作为制备藻类单细胞或原生质体的工具酶,具有良好的应用前景。
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