研究背景及目的:宫颈癌是妇科肿瘤中常见的恶性肿瘤,其发病率仅次于乳腺癌,是威胁女性生命健康的第二大恶性肿瘤。近年来的临床数据显示,宫颈癌的发病有年轻化发展的趋势,且晚期宫颈癌治愈难、易复发,然而目前的治疗手段毒副作用大,因此亟需寻找有效的宫颈癌治疗手段。在可用于宫颈癌治疗的化疗药物中,盐酸吡柔比星为第三代蒽环类抗肿瘤药物。临床试验证明,盐酸吡柔比星还可用于膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌等多种实体肿瘤的治疗,治疗过程中引起的免疫抑制、胃肠道刺激等毒副作用均较顺铂等化疗药物小,具有良好的临床应用前景。但宫颈癌的临床Ⅱ期实验结果显示,大部分宫颈癌患者对盐酸吡柔比星的治疗不敏感。因此,探讨宫颈癌细胞抵抗盐酸吡柔比星的相关机制,寻找相应增敏措施,将有助于宫颈癌的临床治疗。细胞自噬是真核细胞在遭受外界生存环境压力时启动的通过降解自身物质并利用降解产物而补充细胞存活需求的过程。越来越多的研究表明,无论是肿瘤细胞本身对化疗的不敏感,还是后天化疗过程中获得的治疗抵抗,细胞自噬均发挥了重要作用。研究表明,细胞自噬在膀胱癌、乳腺癌等对盐酸吡柔比星及其同类药物的治疗抵抗中发挥重要作用,提示细胞自噬可能是宫颈癌细胞对盐酸吡柔比星治疗不敏感的重要机制。因此,本研究的目的在于探讨细胞自噬在宫颈癌细胞抵抗盐酸吡柔比星中的作用及其分子机制,从而为设计针对性的增敏策略提供依据。研究内容及研究方法:第一部分细胞自噬促进宫颈癌细胞对盐酸吡柔比星治疗抵抗1.验证盐酸吡柔比星对宫颈癌细胞存活及死亡的影响。2.确定盐酸吡柔比星对自噬的诱导作用。3.通过联合使用自噬抑制剂,确定细胞自噬在盐酸吡柔比星杀伤宫颈癌细胞中的作用。第二部分miR34c-5p/ATG4B通路在宫颈癌细胞中介导了盐酸吡柔比星诱导的保护性细胞自噬反应1.经盐酸吡柔比星处理后,分别在m RNA水平及蛋白水平筛选宫颈癌细胞中表达变化最明显的自噬相关分子,并结合基因沉默技术评估其对盐酸吡柔比星所诱导细胞自噬反应的影响,以确定该分子在这一过程中的作用。2.通过双萤光素酶报告基因实验确定盐酸吡柔比星对ATG4B基因转录活性的影响;通过RNA半衰期实验确定盐酸吡柔比星对ATG4B m RNA稳定性的影响。3.分析并筛选靶向ATG4B的micro RNAs,通过RNA半衰期实验确定其在盐酸吡柔比星稳定ATG4B m RNA过程中发挥的作用,通过双萤光素酶报告基因实验证实该micro RNA与ATG4B m RNA间作用的方式及靶点。4.验证miR34c-5p介导的ATG4B下调在盐酸吡柔比星诱导的细胞自噬、细胞凋亡以及抑制细胞存活过程中的作用。5.移植瘤实验体内检测盐酸吡柔比星对miR34c-5p及ATG4B表达的影响。第三部分miR34/ATG4B信号通路在调节细胞自噬过程中的普遍意义1.验证表柔比星及多柔比星是否诱导宫颈癌细胞的保护性细胞自噬反应,以及靶向抑制miR34c-5p或ATG4B能否增敏药物的杀细胞效果。2.检测雷帕霉素诱导的自噬反应中ATG4B、miR34的变化,以及靶向miR34、ATG4B对雷帕霉素诱导的自噬反应是否有影响。根据上述实验内容,主要用到的研究方法有:1.宫颈癌细胞系C33A、Si Ha、He La细胞及卵巢癌SKOV3的体外培养及传代。2.CCK-8实验检测细胞的生长抑制情况。3.台盼蓝染色实验检测细胞的死亡率。4.流式细胞术、Hoechst 33342染色检测细胞的凋亡情况。5.Real-time PCR及Western blot检测细胞中m RNA、蛋白的表达变化。6.分子克隆技术构建质粒。7.瞬时转染技术实现细胞内分子表达量的改变。8.荧光显微镜下观察自噬小点阳性细胞率的改变,确定自噬水平的变化。9.双萤光素酶报告基因实验检测目的基因5’端或3’端活性的改变。10.RNA合成抑制实验检测目的基因m RNA稳定性的改变。11.动物实验证实盐酸吡柔比星对在体宫颈癌的影响。结果:1.盐酸吡柔比星在诱导宫颈癌细胞凋亡的同时还诱导了保护性细胞自噬反应,这是导致宫颈癌细胞对盐酸吡柔比星不敏感的重要机制。2.在宫颈癌细胞中,自噬相关分子ATG4B介导了盐酸吡柔比星诱导的保护性细胞自噬反应。3.在盐酸吡柔比星诱导的保护性细胞自噬反应中,ATG4B上调是由于其自身m RNA稳定性的增强,而不是转录活性的增加。4.miR34a及miR34c-5p均可靶向ATG4B m RNA的3′非翻译区而调节ATG4B的表达水平,但在盐酸吡柔比星处理的宫颈癌细胞中,仅miR34c-5p发挥作用。5.miR34c-5p/ATG4B信号通路在宫颈癌细胞中介导了盐酸吡柔比星诱导的保护性细胞自噬反应。6.移植瘤小鼠实验进一步证实盐酸吡柔比星对在体宫颈癌细胞同样可以诱导miR34c-5p/ATG4B/自噬信号机制的发生。7.miR34/ATG4B信号通路对于自噬水平的调节具有普遍意义。结论:在宫颈癌细胞中,盐酸吡柔比星通过下调miR34c-5p,导致其对ATG4B m RNA的降解减少从而上调了ATG4B的表达,增强了自噬反应。增强的自噬反应对细胞起保护作用,从而导致了宫颈癌细胞对盐酸吡柔比星治疗的不敏感。靶向miR34c-5p或ATG4B均可增敏盐酸吡柔比星对宫颈癌细胞的杀伤作用。miR34/ATG4B信号通路对于自噬水平的调节具有普遍意义。