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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪上呼吸道常在菌,在特定条件感染宿主引起以纤维素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的格拉瑟氏病。Cpx双组份系统是细菌感应外界环境变化的信号传递装置,通过反应调节蛋白Cpx R的磷酸化水平来应对外界环境特定的信号刺激。本课题以副猪嗜血杆菌JS0135为亲本菌株构建Cpx双组份系统基因缺失突变株JS0135-Δcpx A、JS0135-Δcpx R、JS0135-Δcpx AR,进而探索Cpx双组份系统在副猪嗜血杆菌应对刺激中的作用。结果如下:1、JS0135野生株与JS0135 Cpx缺失株环境适应性比较构建重组质粒p K18-cpx A-UKD、p K18-cpx R-UKD、p K18-cpx AR-UKD,自然转化入HPS野生菌株JS0135中,通过kan抗性筛选得到Cpx系统缺失突变株JS0135-Δcpx A、JS0135-Δcpx R、JS0135-Δcpx AR。应激耐受实验显示细菌在高渗透压溶液(0.5M KCl)以及氧化剂(0.1M H2O2)中培养30min后,JS0135-Δcpx R、JS0135-Δcpx AR的存活率显著低于JS0135,JS0135-Δcpx A存活率相对野生菌株JS0135无差异。JS0135和JS0135 Cpx缺失株在碱性溶液(0.02M Na OH)中存活率无差异。平板存活实验显示:在含有庆大霉素的平板上,JS0135-Δcpx A存活能力高于JS0135、JS0135-Δcpx R、JS0135-Δcpx AR;在含有红霉素的平板上JS0135、JS0135-Δcpx A存活能力高于JS0135-Δcpx R、JS0135-Δcpx AR。MIC测定结果显示JS0135、JS0135-Δcpx A对大环内酯类抗生素的最小抑菌浓度高于JS0135-Δcpx R、JS0135-Δcpx AR。2、Cpx双组份系统和HPS粘附能力以及抗吞噬能力相关与猪肾上皮细胞(PK-15)互作后显示JS0135-Δcpx R、JS0135-Δcpx AR的粘附指数显著低于JS0135。JS0135-Δcpx A的粘附指数在30min显著低于野生菌株,在60min、90min时相较野生菌株没有差异。与小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)、猪肺泡巨噬细胞(PAM)互作后显示JS0135-Δcpx R、JS0135-Δcpx AR抗吞噬能力显著高于野生菌株,JS0135-Δcpx A抗吞噬能力显著低于野生菌株。3、荧光定量筛选差异表达基因通过参考文献,筛选出副猪嗜血杆菌16个和细菌毒力以及耐药性相关的基因进行荧光定量检测,结果显示毒力相关基因cdt B和耐药性相关基因prop、HAPS2067差异表达。加入红霉素作为诱导剂进行荧光定量实验,耐药性相关基因prop、acr A、HAPS1938、HAPS2067、HAPS2068出现差异性表达。结果表明Cpx双组份系统对HPS耐药性的调控作用和外排泵相关基因的表达相关。综上所述,Cpx双组份系统和副猪嗜血杆菌应激耐受、耐药性、粘附能力、抗吞噬能力相关。