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结直肠癌(CRC)是全球第三大最常见的恶性疾病，也是第四大最常见的癌症死亡原因。尽管CRC在诊断和治疗方面取得了研究性进展，但由于该病早期症状不明显，初次诊断转移的发生率高，患者的预后较差。因此，CRC严重威胁着人类健康，已经成为全球范围内关注的焦点。近年来，随着我国经济的快速发展，居民生活质量不断提高，生活节奏越来越快，不良生活习惯越来越多，导致我国CRC的发病率和死亡率逐年增高。因此，进一步研究探讨CRC的发生发展机制，将对临床工作具有重要的指导意义。
氨基酮戊酸合成酶(ALAS)是由ALAS1和ALAS2两种基因编码的。ALAS1属于管家基因，是血红素生物合成的限速酶，在全身各处广泛地表达，并参与许多细胞功能。最近的研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)与青蒿素及其衍生物(ARTs)协同作用增加了ALAS1的表达，因此产生的血红素导致了ARTs的细胞毒性增强，从而诱导细胞死亡。张丽等人的研究发现在非小细胞肺癌(NSCLC)中ALAS1蛋白表达水平显著上调，抑制ALAS1的活性降低了NSCLC细胞增殖、集落形成和迁移的能力。然而，目前关于ALAS1在CRC发生发展中的研究比较少。
本论文的研究工作主要涵盖以下三个方面的内容：第一，检测结直肠癌及癌旁正常组织中ALAS1的表达，分析ALAS1的表达量与患者临床病理参数之间的关系，以及ALAS1异常表达与患者预后之间的关系。第二，通过siRNA或琥珀酰丙酮(SA)抑制HCT116细胞中ALAS1的活性，应用CCK-8实验、流式细胞术、平板克隆实验、划痕实验、Transwell小室迁移与基质凝胶实验检测ALAS1对细胞增殖、迁移及侵袭的影响。第三，通过siRNA或SA抑制HCT116细胞中ALAS1的活性，应用流式Annexin-FITC/PI双染法检测ALAS1对细胞凋亡的影响。本研究为进一步探讨ALAS1在CRC发生发展中的相关作用提供了新思路，也为ALAS1在临床诊疗上的应用提供了理论基础。
第一部分ALAS1在结直肠癌组织中的表达及其临床意义
目的：通过对比ALAS1在结直肠癌患者肿瘤组织以及癌旁配对正常组织中的表达情况，分析ALAS1的蛋白表达量与患者临床病理参数之间的关系，以及ALAS1异常表达与患者预后之间的关系。
方法：选取67例结直肠癌患者，所选病例均病理证实为腺癌，标本离体后迅速切取癌组织及近心端癌旁正常组织(肿瘤边缘大于10cm处)，通过qRT-PCR、蛋白质印迹法(Western blot)和免疫荧光实验检测ALAS1在肿瘤组织以及癌旁配对正常组织中的表达。此外，通过Westernblot、免疫荧光实验检测ALAS1在人结肠粘膜上皮细胞株FHC细胞及人结直肠癌细胞株HCT116细胞中的表达。
结果：
1.ALAS1在结直肠癌组织中的表达水平显著升高
通过qRT-PCR、Westernblot、免疫荧光实验发现结直肠癌组织中ALAS1的表达量明显高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结直肠癌组织中ALAS1蛋白的表达水平与患者年龄、性别、肿瘤分化程度无相关性(P＞0.05)，而与侵袭深度、N分期及肿瘤大小密切相关(P＜0.05)。通过Kaplan-Meier生存曲线分析ALAS1的表达水平与结直肠癌患者术后生存期之间的关系，我们发现ALAS1高表达患者的总生存率明显低于ALAS1低表达患者(P=0.04)。
2.ALAS1在结直肠癌细胞株HCT116中的表达水平显著升高
通过Westernblot和免疫荧光实验检测ALAS1在FHC细胞和HCT116细胞中的表达，结果显示HCT116细胞中ALAS1的表达量明显高于FHC细胞，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
结论：ALAS1在结直肠癌组织中表达高于癌旁正常组织，其表达量与侵袭深度、N分期及肿瘤大小呈正相关，与预后呈负相关。ALAS1的表达水平可作为临床评价结肠癌病人预后的独立因子。
第二部分抑制ALAS1的活性对HCT116细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响
目的：通过观察抑制ALAS1的活性对HCT116细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，初步探讨其作用机制。
方法：以HCT116细胞作为研究对象，在siRNA转染或SA抑制ALAS1的活性后，通过CCK-8实验、流式细胞技术和平板克隆实验、划痕实验以及Transwell小室迁移和基质凝胶侵袭实验来检测ALAS1对细胞增殖、迁移及侵袭的影响。通过Westernblot检测细胞增殖相关基因C-myc、PCNA和转移相关基因MMP-2、MMP-9的变化。
结果：
1.ALAS1-siRNA转染HCT116细胞的效果验证
经siRNA转染HCT116细胞后，通过Westernblot验证细胞的转染效果，其中ALAS1-siRNA#2组细胞的沉默效率最高。
2.抑制ALAS1的活性对HCT116细胞增殖能力的影响
通过CCK-8实验检测ALAS1对HCT116细胞增殖能力的影响，敲低ALAS1的表达后HCT116细胞增殖活性受到抑制。平板克隆实验结果也表明实验组的细胞集落形成数目显著减少。为了进一步检测ALAS1对HCT116增殖状态的影响，应用流式细胞仪进行细胞周期的检测，结果显示敲低ALAS1的表达后细胞周期阻止于G0/G1期，S期的分布相对减少。给予细胞SA处理后，实验结果与敲低ALAS1的表达后一致。这些结果表明ALAS1在结直肠癌细胞增殖过程中具有重要作用。
3.抑制ALAS1的活性对HCT116细胞迁移和侵袭能力的影响
通过Transwell小室迁移和基质凝胶侵袭实验，研究ALAS1对HCT116细胞迁移和侵袭能力的影响，与对照组相比，实验组的迁移和侵袭能力下降(P＜0.01)。细胞划痕实验显示：实验组细胞生长缓慢，细胞迁移面积明显减少。给予细胞SA处理后，实验组细胞的迁移和侵袭能力也明显受到抑制(P＜0.01)。这些结果表明ALAS1在结直肠癌细胞迁移和侵袭过程中具有重要作用。
4.抑制ALAS1的活性对HCT116细胞增殖和转移相关基因的调控
通过Westernblot检测抑制ALAS1活性后对HCT116细胞中增殖相关基因C-myc、PCNA和转移相关基因MMP-2、MMP-9的影响。与对照组相比，抑制ALAS1的活性后C-myc和PCNA的蛋白表达量显著下调，MMP-2和MMP-9的蛋白表达量同样出现下调。
结论：
1.通过RNA干扰技术可以将ALAS1-siRNA转染到HCT116细胞中抑制ALAS1表达，且ALAS1-siRNA#2组细胞的转染效果较好。
2.抑制ALAS1的活性后结直肠癌细胞增殖能力受到显著抑制，可能是通过下调PCNA、C-myc的表达水平，从而在结直肠癌细胞的增殖过程中发挥重要作用。
3.抑制ALAS1的活性后结直肠癌细胞迁移和侵袭能力受到显著抑制，可能是通过下调MMP-2和MMP-9的表达水平，从而在结直肠癌细胞的迁移和侵袭过程中发挥重要作用。
第三部分抑制ALAS1的活性对HCT116细胞凋亡能力的影响
目的：通过观察抑制ALAS1的活性对HCT116细胞凋亡能力的影响，初步探讨其作用机制。
方法：以HCT116细胞作为研究对象，经过siRNA转染或SA抑制ALAS1活性后，通过流式Annexin-FITC/PI双染法检测ALAS1对细胞凋亡能力的影响。通过Westernblot检测对凋亡相关基因P53、Bax、Bcl-2、Caspase3的影响。
结果：
1.抑制ALAS1的活性对HCT116细胞凋亡有显著影响
应用流式Annexin-FITC/PI双染法检测ALAS1对HCT116凋亡能力的影响，结果表明：与对照组比较，实验组细胞凋亡率显著升高，其差异具有统计学意义(P＜0.05)。此结果提示ALAS1在结直肠癌细胞凋亡抑制中具有重要作用。
2.抑制ALAS1的活性对结直肠癌细胞凋亡相关基因的调控
通过Westernblot检测抑制ALAS1的活性后对HCT116细胞中凋亡相关基因P53、Bax、Bcl-2、Caspase3的影响。与对照组相比，抑制ALAS1的活性后凋亡相关基因P53、Bax、Caspase3的蛋白表达水平显著升高。而Bcl-2蛋白表达水平则出现下调，其差异具有统计学意义(P＜0.05)。此结果提示抑制ALAS1的活性对结直肠癌细胞凋亡的影响可能与上述相关基因的调控有关。
结论：
抑制ALAS1的活性后减弱了对HCT116细胞的凋亡抑制作用，可能是通过下调细胞中Bcl-2的表达水平，同时上调P53、Bax、Caspase-3的表达水平，从而在结直肠癌细胞的凋亡过程中发挥作用。
氨基酮戊酸合成酶(ALAS)是由ALAS1和ALAS2两种基因编码的。ALAS1属于管家基因，是血红素生物合成的限速酶，在全身各处广泛地表达，并参与许多细胞功能。最近的研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)与青蒿素及其衍生物(ARTs)协同作用增加了ALAS1的表达，因此产生的血红素导致了ARTs的细胞毒性增强，从而诱导细胞死亡。张丽等人的研究发现在非小细胞肺癌(NSCLC)中ALAS1蛋白表达水平显著上调，抑制ALAS1的活性降低了NSCLC细胞增殖、集落形成和迁移的能力。然而，目前关于ALAS1在CRC发生发展中的研究比较少。
本论文的研究工作主要涵盖以下三个方面的内容：第一，检测结直肠癌及癌旁正常组织中ALAS1的表达，分析ALAS1的表达量与患者临床病理参数之间的关系，以及ALAS1异常表达与患者预后之间的关系。第二，通过siRNA或琥珀酰丙酮(SA)抑制HCT116细胞中ALAS1的活性，应用CCK-8实验、流式细胞术、平板克隆实验、划痕实验、Transwell小室迁移与基质凝胶实验检测ALAS1对细胞增殖、迁移及侵袭的影响。第三，通过siRNA或SA抑制HCT116细胞中ALAS1的活性，应用流式Annexin-FITC/PI双染法检测ALAS1对细胞凋亡的影响。本研究为进一步探讨ALAS1在CRC发生发展中的相关作用提供了新思路，也为ALAS1在临床诊疗上的应用提供了理论基础。
第一部分ALAS1在结直肠癌组织中的表达及其临床意义
目的：通过对比ALAS1在结直肠癌患者肿瘤组织以及癌旁配对正常组织中的表达情况，分析ALAS1的蛋白表达量与患者临床病理参数之间的关系，以及ALAS1异常表达与患者预后之间的关系。
方法：选取67例结直肠癌患者，所选病例均病理证实为腺癌，标本离体后迅速切取癌组织及近心端癌旁正常组织(肿瘤边缘大于10cm处)，通过qRT-PCR、蛋白质印迹法(Western blot)和免疫荧光实验检测ALAS1在肿瘤组织以及癌旁配对正常组织中的表达。此外，通过Westernblot、免疫荧光实验检测ALAS1在人结肠粘膜上皮细胞株FHC细胞及人结直肠癌细胞株HCT116细胞中的表达。
结果：
1.ALAS1在结直肠癌组织中的表达水平显著升高
通过qRT-PCR、Westernblot、免疫荧光实验发现结直肠癌组织中ALAS1的表达量明显高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结直肠癌组织中ALAS1蛋白的表达水平与患者年龄、性别、肿瘤分化程度无相关性(P＞0.05)，而与侵袭深度、N分期及肿瘤大小密切相关(P＜0.05)。通过Kaplan-Meier生存曲线分析ALAS1的表达水平与结直肠癌患者术后生存期之间的关系，我们发现ALAS1高表达患者的总生存率明显低于ALAS1低表达患者(P=0.04)。
2.ALAS1在结直肠癌细胞株HCT116中的表达水平显著升高
通过Westernblot和免疫荧光实验检测ALAS1在FHC细胞和HCT116细胞中的表达，结果显示HCT116细胞中ALAS1的表达量明显高于FHC细胞，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
结论：ALAS1在结直肠癌组织中表达高于癌旁正常组织，其表达量与侵袭深度、N分期及肿瘤大小呈正相关，与预后呈负相关。ALAS1的表达水平可作为临床评价结肠癌病人预后的独立因子。
第二部分抑制ALAS1的活性对HCT116细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响
目的：通过观察抑制ALAS1的活性对HCT116细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，初步探讨其作用机制。
方法：以HCT116细胞作为研究对象，在siRNA转染或SA抑制ALAS1的活性后，通过CCK-8实验、流式细胞技术和平板克隆实验、划痕实验以及Transwell小室迁移和基质凝胶侵袭实验来检测ALAS1对细胞增殖、迁移及侵袭的影响。通过Westernblot检测细胞增殖相关基因C-myc、PCNA和转移相关基因MMP-2、MMP-9的变化。
结果：
1.ALAS1-siRNA转染HCT116细胞的效果验证
经siRNA转染HCT116细胞后，通过Westernblot验证细胞的转染效果，其中ALAS1-siRNA#2组细胞的沉默效率最高。
2.抑制ALAS1的活性对HCT116细胞增殖能力的影响
通过CCK-8实验检测ALAS1对HCT116细胞增殖能力的影响，敲低ALAS1的表达后HCT116细胞增殖活性受到抑制。平板克隆实验结果也表明实验组的细胞集落形成数目显著减少。为了进一步检测ALAS1对HCT116增殖状态的影响，应用流式细胞仪进行细胞周期的检测，结果显示敲低ALAS1的表达后细胞周期阻止于G0/G1期，S期的分布相对减少。给予细胞SA处理后，实验结果与敲低ALAS1的表达后一致。这些结果表明ALAS1在结直肠癌细胞增殖过程中具有重要作用。
3.抑制ALAS1的活性对HCT116细胞迁移和侵袭能力的影响
通过Transwell小室迁移和基质凝胶侵袭实验，研究ALAS1对HCT116细胞迁移和侵袭能力的影响，与对照组相比，实验组的迁移和侵袭能力下降(P＜0.01)。细胞划痕实验显示：实验组细胞生长缓慢，细胞迁移面积明显减少。给予细胞SA处理后，实验组细胞的迁移和侵袭能力也明显受到抑制(P＜0.01)。这些结果表明ALAS1在结直肠癌细胞迁移和侵袭过程中具有重要作用。
4.抑制ALAS1的活性对HCT116细胞增殖和转移相关基因的调控
通过Westernblot检测抑制ALAS1活性后对HCT116细胞中增殖相关基因C-myc、PCNA和转移相关基因MMP-2、MMP-9的影响。与对照组相比，抑制ALAS1的活性后C-myc和PCNA的蛋白表达量显著下调，MMP-2和MMP-9的蛋白表达量同样出现下调。
结论：
1.通过RNA干扰技术可以将ALAS1-siRNA转染到HCT116细胞中抑制ALAS1表达，且ALAS1-siRNA#2组细胞的转染效果较好。
2.抑制ALAS1的活性后结直肠癌细胞增殖能力受到显著抑制，可能是通过下调PCNA、C-myc的表达水平，从而在结直肠癌细胞的增殖过程中发挥重要作用。
3.抑制ALAS1的活性后结直肠癌细胞迁移和侵袭能力受到显著抑制，可能是通过下调MMP-2和MMP-9的表达水平，从而在结直肠癌细胞的迁移和侵袭过程中发挥重要作用。
第三部分抑制ALAS1的活性对HCT116细胞凋亡能力的影响
目的：通过观察抑制ALAS1的活性对HCT116细胞凋亡能力的影响，初步探讨其作用机制。
方法：以HCT116细胞作为研究对象，经过siRNA转染或SA抑制ALAS1活性后，通过流式Annexin-FITC/PI双染法检测ALAS1对细胞凋亡能力的影响。通过Westernblot检测对凋亡相关基因P53、Bax、Bcl-2、Caspase3的影响。
结果：
1.抑制ALAS1的活性对HCT116细胞凋亡有显著影响
应用流式Annexin-FITC/PI双染法检测ALAS1对HCT116凋亡能力的影响，结果表明：与对照组比较，实验组细胞凋亡率显著升高，其差异具有统计学意义(P＜0.05)。此结果提示ALAS1在结直肠癌细胞凋亡抑制中具有重要作用。
2.抑制ALAS1的活性对结直肠癌细胞凋亡相关基因的调控
通过Westernblot检测抑制ALAS1的活性后对HCT116细胞中凋亡相关基因P53、Bax、Bcl-2、Caspase3的影响。与对照组相比，抑制ALAS1的活性后凋亡相关基因P53、Bax、Caspase3的蛋白表达水平显著升高。而Bcl-2蛋白表达水平则出现下调，其差异具有统计学意义(P＜0.05)。此结果提示抑制ALAS1的活性对结直肠癌细胞凋亡的影响可能与上述相关基因的调控有关。
结论：
抑制ALAS1的活性后减弱了对HCT116细胞的凋亡抑制作用，可能是通过下调细胞中Bcl-2的表达水平，同时上调P53、Bax、Caspase-3的表达水平，从而在结直肠癌细胞的凋亡过程中发挥作用。