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肿瘤微环境是肿瘤发育的“土壤”。缺氧是胰腺癌微环境重要的理化特征之一,在驱动肿瘤发生发展中发挥重要作用。胰腺癌血供缺乏,且间质比例高(大于90%),是造成胰腺癌细胞缺氧微环境形成的重要原因。缺氧微环境在胰腺癌细胞增殖、侵袭和转移的过程发挥重要的调节作用。其中,缺氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor1α,HIF-1α)是缺氧微环境最为重要的调节因子之一。HIF-1α及其下游通路已被证实参与了胰腺癌发生、侵袭、转移、新生血管形成和药物抵抗的全过程,同患者的不良预后密切相关。因此,明确HIF-1α调控胰腺癌侵袭转移相关的靶基因,探究缺氧微环境下信号通路激活的相关机制对寻找胰腺癌新的临床治疗靶点仍有重要意义。丝氨酸/苏氨酸激酶33(Serine/Threonine Kinase 33,STK33)是钙/钙调蛋白依赖性激酶家族的成员,位于人体的11号染色体。STK33在正常人的睾丸、胎肺和心脏等组织中高表达,在肝、胃和胰腺等组织中低表达,以胞浆分布为主。研究发现STK33在肝癌、鼻咽癌、肺癌等多种癌症组织中高表达并表现出显著的癌基因特性。机制研究发现STK33具有自磷酸化功能,同时通过对下游基因(如Vimentin蛋白)的磷酸化修饰影响下游基因的生物学功能。近期研究表明肝癌中STK33可以通过非激酶活性依赖途径影响C-Myc基因的转录作用,提示STK33可以通过多种方式发挥促癌作用。另有研究发现STK33在携带KRAS突变的细胞系中特异性高表达,且抑制STK33的表达可显著抑制携带KRAS突变的肿瘤细胞的生长和侵袭能力,提示其可能是胰腺癌等KRAS突变相关肿瘤的重要治疗靶点。有文献报道缺氧诱导因子HIF-1α可以诱导KRAS信号通路的激活。课题组生物信息学分析发现STK33与HIF-1α表达密切相关,且STK33启动子区域存在多个HIF-1α结合缺氧反应原件(Hypoxia responsive element,HRE),因此我们提出科学假说:缺氧条件下HIF-1α通过转录调控STK33的表达促进胰腺癌细胞的恶性进展。本课题旨在研究胰腺癌中缺氧微环境中STK33的表达水平,探究STK33在胰腺癌增殖、转移和侵袭过程中的作用。本研究证实缺氧处理可显著升高胰腺癌细胞中STK33的表达水平,同时STK33在缺氧环境中受到HIF-1α的转录调控。体内体外功能研究结果表明STK33过表达可显著提高胰腺癌细胞增殖和侵袭能力,低表达STK33可显著抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭能力。临床组织样本分析发现STK33在胰腺癌患者组织中显著高表达,且STK33的表达水平与胰腺癌分化程度等多个病理参数及不良预后密切相关。此外,存在STK33细胞核表达为主的患者的生存期显著低于浆表达为主的患者。STK33显著的促癌作用以及密切的临床相关性,提示STK33可能是胰腺癌临床治疗的重要靶点。第一部分缺氧环境下HIF-1α调控STK33在胰腺癌细胞中的表达目的:缺氧条件下(1%O2)培养胰腺癌细胞,观察HIF-1α与STK33的蛋白的表达变化,明确HIF-1α调控STK33变化的分子机制。方法:使用缺氧培养箱,在缺氧(1%O2)环境中培养胰腺癌细胞,分别采用real-time PCR和Western blot的方法在0h、6h、12h、24h和48h检测STK33的mRNA以及两者的蛋白表达水平。利用不同浓度的CoCl2模拟缺氧微环境,培养24h后分别检测STK33的mRNA以及两者的蛋白表达水平。分别在胰腺癌细胞中过表达和抑制HIF-1α,检测STK33的蛋白表达变化。采用双荧光素梅报告基因和染色质免疫共沉淀实验明确HIF-1α转录调控STK33的结合位点。结果:缺氧(1%O2)处理胰腺癌细胞后,STK33的mRNA和蛋白表达、HIF-1α蛋白表达明显升高。CoCl2处理后的胰腺癌细胞,STK33的mRNA和蛋白表达、HIF-1α蛋白表达明显升高,且呈现浓度依赖性。胰腺癌细胞中过表达HIF-1α质粒,STK33的mRNA和蛋白表达水平均显著升高;相反,转染HIF-1α特异性siRNA可显著下调STK33的表达水平。双荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀的实验结果提示HIF-1α靶向识别STK33启动子区域HRE2,激活STK33的转录。结论:缺氧条件下,HIF-1α转录激活STK33的表达过程。第二部分缺氧诱导STK33表达对胰腺癌生物学功能的影响目的:研究STK33在胰腺癌增殖、转移、侵袭等生物学功能中的作用。方法:采用Western blot的方法检测不同胰腺癌细胞系中STK33的相对表达量。选取高表达细胞系转染STK33小干扰RNA(siRNA),选取低表达细胞系转染STK33过表达质粒。分别采用CCK8、Transwell侵袭和转移实验和划痕实验体外观察胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力的变化。在缺氧条件下(1%O2),抑制STK33的表达,观察胰腺癌细胞侵袭能力的变化。裸鼠皮下接种胰腺癌细胞,观察STK33对体内肿瘤生长过程的影响。结果:体内外实验结果表明过表达STK33可显著提高胰腺癌细胞增殖、转移和侵袭能力,相反,抑制STK33表达可显著降低胰腺癌细胞增殖、转移和侵袭能力。缺氧处理可显著增强胰腺癌细胞的运动侵袭能力,而缺氧环境中干扰STK33的表达可部分抑制胰腺癌细胞运动侵袭能力的提高。结论:STK33是促进胰腺癌细胞恶性生物学行为的重要调控因子。第三部分STK33在胰腺癌组织中的表达及其临床意义目的:检测STK33在胰腺癌组织中的表达水平,分析其在判断病理分级、评价预后等方面的临床意义。方法:采用Western blot的方法检测5对胰腺癌与癌旁组织STK33的蛋白表达水平,以β-Actin为内参,观察差异性表达。采用免疫组织化学染色的方法检测胰腺癌组织芯片(98例))中STK33以及HIF-1α的蛋白表达水平,分析两者表达的相关性,评价HIF-1α、STK33表达量以及两者联合评估患者预后的临床价值,统计STK33与临床病理特征的相关性,研究STK33的亚细胞定位及其对临床预后的价值。结果:从蛋白水平观察,胰腺癌组织中STK33的表达水平显著高于癌旁组织。组织芯片免疫组织化学染色的结果显示:98例胰腺癌组织中STK33与HIF表达呈显著正相关;STK33高表达与HIF-1α高表达患者的总体生存期均低于STK33低表达与HIF低表达组,且同时高表达HIF-1α和STK33的患者生存期低于单个指标高表达的患者。临床病理特征的相关性分析提示STK33的表达水平与胰腺癌病理分化程度呈正相关。STK33在胞核和胞浆均可表达,胞核表达的患者总体生存期低于胞浆表达的患者。结论:STK33与HIF的蛋白表达呈正相关。胰腺癌中STK33表达水平与患者的病理分级密切相关。胰腺癌患者STK33高表达提示预后不良,且STK33的亚细胞定位也是评价患者预后的重要指标。