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背景和目的:自然杀伤(natural killer,NK)细胞属于人体固有免疫系统,是机体抵御病毒感染和肿瘤的第一道重要防线。杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immnoglobulin-like receptors,KIRs)是表达在人NK细胞表面、具有多态性的分子家族。人NK细胞对靶细胞的识别主要依赖于KIRs对靶细胞表面的人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)I类分子的监视。不同KIR可以传递抑制性或激活性信号,两者之间的平衡状态决定了NK细胞杀伤靶细胞的效应功能。抑制性KIRs不仅对肿瘤和病毒感染发挥免疫监视作用,而且在区分正常和异常细胞的免疫耐受中同样发挥重要作用。因此,明确抑制性KIR因表达调控机制及其与NK细胞功能的联系有助于在体内、外调控NK细胞。本研究分析了DNA甲基化和转录因子E2F对KIR基因表达的调控作用,并观察了去甲基化处理对NK细胞杀伤活力的影响。方法:(1)为分析KIR3DL1基因启动子甲基化模式及其与基因表达的关系,采用亚硫酸氢盐测序法检测表达KIR3DL1的人NK细胞系NK-92MI和不表达KIR3DL1的人白血病细胞系K562中KIR3DL1启动子区CpG岛甲基化模式,然后应用甲基化抑制剂5-氮胞苷(5-azacytidine,5-Aza)处理NK-92MI细胞以诱导CpG岛去甲基化,RT-PCR检测KIR3DL1基因表达水平。为明确转录因子E2F在调控KIR3DL1启动子转录活性中的作用,采用PCR分别从K562细胞基因组DNA和含有野生型KIR3DL1启动子序列的质粒中扩增突变型和野生型KIR3DL1基因核心启动子序列,产物分别连接入pGL3-Basic荧光素酶载体构建报告重组质粒;采用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)方法检测E2F1与KIR3DL1启动子在细胞内的结合;采用阳离子脂质体SuperFect包裹突变型和野生型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组质粒转染K562细胞,CHIP方法检测E2F1与重组质粒在细胞内的结合,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性;最后,将E2F1真核表达载体与KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组质粒共转染K562细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。(2)为明确DNA去甲基化对NK细胞杀伤功能的直接影响及机制,采用亚硫酸氢盐测序法检测NK-92MI细胞中抑制性KIR基因启动子区甲基化模式,RT-PCR和流式细胞仪检测5-Aza处理前后的NK细胞抑制性KIR基因表达水平;采用5-Aza分别处理NK-92MI细胞和新鲜分离的人外周血NK细胞,并采用流式细胞仪将NK细胞群分选为KIR3DL1阳性和KIR3DL1阴性细胞亚群,采用乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞对K562细胞的杀伤活力;采用酶联免疫吸附试验检测NK细胞释放粒酶B和穿孔素的水平。结果:(1)NK-92MI和K562细胞中,KIR3DL1基因核心启动子区存在高甲基化,采用5-Aza处理能够诱导NK-92MI和K562细胞KIR3DL1基因表达水平增加。测序证实,在K562细胞中,KIR3DL1启动子区一个潜在的转录因子E2F结合位点上有一个自然发生的点突变(TT(?)GGCGC→TT(?)GGCGC),这一突变引入了一个新的被甲基化的CpG二核苷酸位点;E2F1能与NK-92MI细胞中野生型KIR3DL1启动子结合,上述结合位点的突变使它们在K562细胞中的结合完全丧失;突变型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组质粒保留了部分与E2F1的结合能力;突变型KIR3DL1启动子的相对荧光素酶活性较野生型降低了50%;共转染E2F1表达载体使野生型KIR3DL1启动子的相对荧光素酶活性较对照组增加了2.4倍。(2)NK-92MI细胞中抑制性KIR基因(KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3和KIR3DL1)由于启动子区存在高甲基化而呈现特征性的表达抑制状态,5-Aza处理可以诱导这些抑制性KIR基因表达增加;经5-Aza处理的NK-92MI细胞和新鲜分离的人外周血NK细胞对K562细胞的杀伤活力则明显受到抑制,此外,NK细胞释放粒酶B和穿孔素的水平也明显降低;在5-Aza处理后的NK细胞群中,KIR3DL1阴性细胞亚群的杀伤活力、释放粒酶B和穿孔素的水平均高于KIR3DL1阳性细胞亚群。结论:NK细胞KIR3DL1基因表达受启动子甲基化调控。转录因子E2F1参与调控KIR3DL1基因转录激活。去甲基化处理抑制NK细胞的杀伤活力,该作用可能与去甲基化处理诱导的抑制性KIR基因过表达及细胞毒性颗粒释放减少有关。