论文部分内容阅读
目的应用巢式甲基特异性PCR法(nested methylation specific PCR,nMSP)和DNA克隆测序检测恶性血液病细胞株APC基因,即腺瘤性结肠息肉病相关基因(ademomatous poylposis coli,APC)的甲基化状态,筛选出APC基因启动子高甲基化的肿瘤细胞株,将其作为研究基因甲基化与表达关系的细胞模型。进一步探讨APC基因甲基化与白血病发生、发展可能的关系,从而进一步阐明白血病发生、发展的可能机制;探讨雷公藤内酯醇(triptolid,TPL)逆转人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞系APC基因甲基化状态及调节转录作用、诱导蛋白重新表达及其可能的机制。方法采用nMSP和DNA克隆测序检测多种恶性血液病细胞株APC基因的甲基化状态;采用MTT法检测TPL对APC基因高甲基化的人急性淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞增殖、活力的影响;应用流式细胞仪DNA倍体分析法探讨TPL对Jurkat细胞周期的影响;nMSP法检测药物作用前后APC甲基化状态变化;RT-PCR法检测APC、甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B基因mRNA的表达;Westren Blot蛋白免疫印迹法检测APC蛋白的表达。结果1.十种恶性血液病细胞株,其中CA46、U266、Molt4、K562、HL-60、CEM、AKR、U937、Raji的APC基因启动子区均未甲基化,而Jurkat的APC基因启动子区出现甲基化。2.与对照组相比,不同浓度TPL作用后均可抑制Jurkat细胞增殖、诱导细胞分化,G0-G1期细胞比例增加;3. TPL作用48h后Jurkat细胞APC基因甲基化程度明显减弱,APC基因异常甲基化的现象被逆转;4.未处理组Jurkat细胞APC基因不表达,TPL作用48h后APC基因在mRNA和蛋白水平表达增强;5.与未处理组相比,APC作用48h后Jurkat细胞甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B的表达下降并呈浓度依赖性,而DNMT1表达不受影响。结论1.nMSP法灵敏度高、特异性强,可以应用于各种甲基化状态检测; 2.TPL在体外能够诱导Jurkat细胞中异常高甲基化的抑癌基因APC基因启动子CpG岛DNA去甲基化,从而恢复APC基因mRNA水平和蛋白水平的表达,实现其细胞周期调控功能,将细胞阻滞于G0-G1期,抑制肿瘤细胞的增长;3.TPL在体外对Jurkat细胞逆转甲基化的机制之一可能与直接抑制甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B或(和)通过S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)间接抑制DNMTs从而逆转APC基因甲基化状态有关。