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乳蛋白是影响乳制品营养品质的主要物质基础,决定着奶业的经济价值与核心竞争力。生物节律普遍存在于生物机体中且对正常生理生化活动存在一定的调控作用。课题组前期体外奶牛乳腺上皮细胞中的研究表明,占乳蛋白总量绝大比例(约76%～86%)的酪蛋白的表达量受生物钟基因Period2低表达的影响,但其中具体的调控作用和机制尚不明确。因此,本研究结合体内外试验,通过奶牛乳腺上皮细胞体外沉默及小鼠体内敲除Period2基因,探究Period2影响乳腺发育、酪蛋白合成的转录翻译信号通路分子机制。试验一、Period2基因沉默影响奶牛乳腺上皮细胞增殖及酪蛋白合成的通路机制基于前期体外细胞试验结果,本部分进一步探索了Period2基因沉默促进奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成的机制。试验选用第4代奶牛乳腺上皮细胞,设置对照组和沉默组。沉默组采用瞬时转染技术转染特异性小干扰RNA(siRNA),对照组不做处理。24h沉默完全后采用CCK8法检测细胞增殖活性,采用流式细胞术测定细胞凋亡和细胞周期分布;采用qRT-PCR和Western blot测定酪蛋白合成信号通路相关分子的基因和蛋白质水平变化。结果发现:转染后的24 h和30 h,沉默组细胞的增殖活性均显著高于对照组(P<0.05)。相反,Period2基因沉默显著降低了细胞的凋亡率(P<0.05);显著抑制了促凋亡基因P53、Bax、Casp8和Casp3的表达,提高了抑凋亡基因Bcl-2的表达(P<0.05)。沉默组处于G0/G1的细胞比例相比于对照组极显著降低(P<0.01),S期和G2/M期的细胞比例有升高的趋势(P>0.05);细胞周期相关基因Wee1、Cdkn2a、Cdkn1a、Ccnd1和Cdk2的表达水平显著降低,E2f1、Cdk4、c-Myc和Rb1基因的表达水平显著提高(P<0.05),解释了细胞由G1向S期的转化。另外,沉默组中酪蛋白合成信号通路因子Jak2、Stat5a、Pik3c3、Pdk1和Akt2基因的表达量显著提高,4ebp1基因的表达量显著降低(P<0.05)。mTOR总蛋白丰度及p-mTOR及其占总mTOR的比例均有升高的趋势(P>0.05)。本部分结果提示,Period2基因沉默可能通过促进细胞增殖、抑制凋亡和重新分配细胞周期,为乳成分合成提供生理基础;同时通过促进酪蛋白合成关键激酶JAK2-STAT5和PI3K-AKT-mTOR通路而直接调控酪蛋白的转录、翻译过程,共同作用提高奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白的合成。试验二、小鼠乳腺组织酪蛋白合成及泌乳相关激素日节律的探究为后续进一步研究体内生物钟基因Period2对乳腺酪蛋白合成的影响与调控机制,本部分试验探索了乳腺酪蛋白合成及泌乳相关激素分泌是否存在日节律以及与Period2基因表达的相关性。试验以野生C57BL/6N小鼠为试验动物,在12L:12D的交替光周期中饲养配对至分娩泌乳,24h内间隔4h选取6个昼夜时点(ZT0、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16、ZT20)采集母鼠(n=4)的乳腺组织及血清样品,检测乳腺Period2基因,3种酪蛋白及其合成信号通路相关分子的表达量以及血清泌乳相关激素水平的节律变化。结果显示:小鼠乳腺Period2基因表达呈拟余弦函数的日节律变化,在ZT0和ZT4时表达量最高(P<0.05),之后逐步降低至ZT20时的谷值。Csn1s1、Csn2和Csn3基因表达量以及对应的3种酪蛋白丰度均表现显著的日节律变化(P<0.05),且相关回归分析表明,Period2基因表达量与Csn1s1基因在全天、光照时段和黑暗时段的表达量呈负相关(P>0.05),与Csn2基因(P<0.05)和Csn3基因(P>0.05)的表达量呈线性正相关关系;相反,与αs1-酪蛋白丰度呈正相关(P>0.05),而与β-酪蛋白(P>0.05)和κ-酪蛋白(P<0.05)呈线性负相关关系。另外,酪蛋白合成信号通路基因Jak2、Mtor和4ebp1的相对表达量,以及泌乳相关激素催乳素(PRL)、催乳素释放激素(PRH)、生长激素(GH)和促生长激素释放激素(GHRIH)浓度水平表现24 h日节律变化(P<0.05)。相关回归分析表明,Period2基因表达量与PRL浓度有显著的线性负相关关系(P<0.05),与PRH、GH和GHRH浓度变化均呈正相关趋势(P>0.05)。对于激素之间,PRL和PRH浓度均与GH和GHRH的浓度变化呈负相关趋势(P>0.05),可能与竞争性结合激素受体有关。本部分结果表明,小鼠乳腺Period2基因表达分别与3种酪蛋白基因表达和对应的酪蛋白丰度的节律变化的相关性相反,可能与酪蛋白合成信号通路分子和泌乳相关激素及其对应的促激素释放激素表达的日节律变化有关,共同受生物钟基因的节律调控。试验三、Period2基因敲除对分娩后母鼠乳腺发育及其酪蛋白合成的影响基于体外细胞试验及对体内乳腺组织酪蛋白合成及泌乳相关激素日节律探索结果,本部分试验进一步验证体内Period2基因敲除是否对分娩后小鼠乳腺发育及其酪蛋白合成产生一致的影响。以全身性Period2基因敲除的纯合(Period2-/-)和野生(Period2+/+)C57BL/6N品系小鼠作为试验动物,分别为敲除组和对照组。12L:12D的交替光周期中饲喂配种至分娩泌乳,每组采集8只泌乳后期(L14±2)母鼠的乳腺组织。制作石蜡切片检测乳腺组织发育水平,同时qRT-PCR和ELISA法测定乳腺细胞凋亡相关基因和3种酪蛋白基因及蛋白的表达量。结果显示,敲除Period2基因后在mRNA和蛋白水平的表达均显著降低。与细胞学试验结果一致,敲除组乳腺腺泡相对于对照组较为规则,腺泡切面面积显著提高(P<0.05);促凋亡基因Bax和Casp8的表达显著降低(P<0.05),凋亡抑制基因Bcl-2的表达水平显著提高(P<0.05)。与此同时,小鼠乳腺Csn1s1、Csn2和Csn3三种酪蛋白基因和对应的asl-、β-和κ-酪蛋白含量相比于对照组均显著性地提高(P<0.05)。本部分结果证实,敲除小鼠Period2基因可以促进乳腺组织的发育,抑制组织凋亡水平,同时促进了乳腺组织酪蛋白的合成。试验四、Period2基因敲除影响分娩后母鼠乳腺酪蛋白合成的信号通路的分析本试验进一步通过体内Period2基因敲除,研究其影响分娩后小鼠乳腺酪蛋白合成的信号通路分子机制。在试验三试验设计的基础上采集敲除组(Period2-/-)和野生组(Period2+/+)母鼠(n=8)的乳腺组织,采用qRT-PCR和Wstern blot法测定氨基酸转运载体、酪蛋白合成的转录翻译通路相关因子、泌乳相关激素及其受体基因的表达量。结果显示,敲除组小鼠的乳腺氨基酸转运载体Slc7a1和Slc38a2基因的表达量有提高的趋势(P>0.05)。敲除组Jak2、Stat5a,Stat5b、S6k1和Rps6基因表达量显著高于对照组(P<0.05);Mtor基因和总mTOR蛋白的表达量在两组之间无显著性差异(P>0.05),但敲除组mTOR蛋白磷酸化水平显著提高(P<0.05)。与此同时,乳腺Prl、Ghr、Igf-1和Igf-1r基因的表达量相对于对照组显著提高(P<0.05)。本部分结果证实,Period2基因敲除可能通过促进小鼠乳腺PRL和GH(包括下游靶基因IGF-1及其受体)介导的JAK2-STAT5和mTOR通路分子的表达而促进乳腺酪蛋白的合成。综上:1)体外奶牛乳腺上皮细胞Period2基因沉默可能通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡和影响细胞周期分布,从而提高泌乳细胞数目,为酪蛋白合成提供生理基础;与此同时,通过调控JAK2-STAT5通路直接影响酪蛋白的转录、翻译过程,共同促进乳腺酪蛋白的合成。2)小鼠生物钟基因Period2表现出拟余弦函数的日节律变化,与酪蛋白基因在同一昼夜时间段内的节律变化有正相关性,但与对应的酪蛋白丰度变化呈负相关,可能与酪蛋白合成信号通路分子和泌乳相关激素表达的日节律变化有关,因此共同受生物钟基因的节律调控,为进一步体内研究Period2敲除影响酪蛋白合成及其分子机制提供研究基础。3)体内Periodd2基因敲除小鼠试验研究发现,Period2基因低表达显著促进分娩后小鼠乳腺腺泡生长发育,提高了 3种酪蛋白的表达量。4)小鼠Period2基因的敲除,可能通过调控泌乳相关激素介导的JAK2-STAT5和mTOR通路,进而影响乳腺组织生长发育间接和直接影响酪蛋白的合成。