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近年来利用植物油体表达系统这一新型植物反应器生产目的蛋白,是生物反应器研究的热点。它具有生产成本低、来源广、易于大规模生产、不含危害人类健康的病原生物(与微生物和动物反应系统相比)等优点,并且重组蛋白可以在种子内长期、稳定地贮存而不被降解。透明质酸酶(Hyaluronidases,简称HAase)是一类广泛存在于动物组织和微生物中的酶,又被称之为“扩散因子”。能特异性水解透明质酸(Hyaluronan,简称HA)及少量的硫酸软骨素A和C。HAase广泛应用于眼科手术、肿瘤及心肌梗塞的治疗等其他辅助治疗上。目前市售的HAase多数是从动物(牛、羊)睾丸组织中提取的,其纯度低,免疫原性强,对治疗有较大的危险性。近年来也有用动物细胞表达系统表达人类透明质酸酶PH20(hPH20),但其本身容易与内源性蛋白发生反应,还易被动物本身含有的病原体所污染,且成本高,价格昂贵。而用植物表达系统表达hPH20则不存在这样的问题,因为植物本身不含有HAase,也不会与植物蛋白发生相互反应或相互作用,且植物价格低廉,来源广,易于大规模生产,可大大降低生产成本。因此本实验探索利用拟南芥和红花的种子来特异性表达hPH20。主要研究结果如下:1、植物表达载体pOTBar-hPH20的构建:将hPH20基因进行植物偏好性优化合成后插入到油体融合蛋白植物高效表达载体上,形成pOTBar-hPH20重组质粒。利用冻融法将重组质粒转化至农杆菌EHA105中。2、农杆菌介导的拟南芥转化:采用Flora-Dip法侵染拟南芥,后经过Basta筛选后获得转基因株系,对转基因拟南芥种子进行蛋白水平上的检测(:1)SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白oleosin-hPH20已成功在转基因拟南芥种子中得到表达。(2)酶活实验结果表明:利用转基因拟南芥种子表达的oleosin-hPH20具有透明质酸酶活性,比活性范围为2~6U/mL。3、农杆菌介导的红花转化:以新疆裕民无刺红花为植物材料,利用农杆菌介导法,对红花进行遗传转化。用含1%Basta的培养基进行转基因植株抗性筛选,获得抗性苗。进行PCR检测,结果显示:重组蛋白hPH20已成功整合到转基因红花基因组中。本实验成功的利用转基因拟南芥和红花种子特异性表达了人类透明质酸酶(hPH20),并证明了利用转基因拟南芥种子特异性表达的重组蛋白oleosin-hPH20具有生物学活性。实验结果为利用植物油体表达系统生产药用蛋白奠定了基础,同时提供了一个可能使用的大规模生产hPH20的方法。