脂质体介导的TGF-β1基因转染抑制人晶状体上皮细胞增殖的实验研究前言白内障是最常见的致盲眼病之一，其发病机制尚不完全明确。研究发现在白内障形成的过程中，晶状体上皮细胞发生了一系列退行性及增殖性改变，同时晶状体上皮细胞的形态改变也与白内障的类型密切相关。近年来各种细胞因子的作用成为研究白内障的热点。许多研究表明，转化生长因子TGF-β1与白内障的发生相关，但其具体作用机制尚未被详尽了解。转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一组具有调节细胞生长和分化功能的超家族多肽，具有调节多种细胞的增殖与分化，诱导细胞凋亡，刺激细胞外基质的分泌与沉积，促进血管生成、结缔组织形成，抑制免疫等重要作用转基因技术(gene transfer)是指将克隆化的外源基因通过特定的手段导入真核细胞的方法，具有以下优点：1、受体细胞可持续高效地表达目的基因，以调控其自身和其他效应细胞生长并获得所需特定功能；2、转基因细胞合成分泌的内源性蛋白经过适当的翻译后修饰过程，能够更有效地同细胞表面受体结合，表达产物的生物活性更高；3、价格远低于纯化的重组蛋白。因此，若结合应用转基因技术，将外源性TGF-β1基因导入人晶状体上皮细胞，将无疑对研究白内障的发生机制具有重要意义。目的利用转基因技术构建pEGFP-TGF-β1真核基因载体，通过脂质体介导转染人晶状体上皮细胞系(HLEC-B3)，探讨增强型绿色荧光蛋白EGFP在人晶状体上皮细胞中的表达及可能的应用前景，研究转化生长因子TGF-β1对人晶状体上皮细胞增殖与凋亡及其对细胞周期调控的影响，探讨其在白内障发生机制中的作用。方法1、永生化人晶状体上皮细胞的培养：将冻存的晶状体上皮细胞复苏后，放入含15％胎牛血清、100mg／L青霉素及125mg／L链霉素的HG-DMEM培养基中，置于5％CO2、37℃的细胞培养箱内培养，取融合至90％的细胞用于实验。2、增强型绿色荧光蛋白pEGFP-TGF-β1质粒构建、筛选、扩增和鉴定：将pSNAV-TGF-β1和pEGFP-C2质粒分别用EcoRⅠ／SnalⅠ双酶切，回收所需的DNA片段，酶切鉴定。用TaKaRa DNA Ligation Kit中的SolutionⅠ，将Insert DNA和Vector DNA连接后，热转化至DH5a中，涂布平板过夜培养菌体。挑选单菌落，提取质粒DNA，酶切鉴定。质粒提取。3、脂质体介导的pEGFP-TGF-β1转染HLEC-B3∶5％CO2、37℃细胞培养箱内培养至细胞融合密度90％的细胞进行转染，按照Lipofectamine2000使用说明进行转染，6h后更换完全生长培养液。设立正常组、空染组和转染组，选取24h、48h、72h、96h不同时间点，荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白在晶状体上皮细胞中的表达。4、倒置显微镜下观察不同时间点转染细胞的形态变化，测转染率；荧光显微镜下观察转染的EGFP在HLEC中的表达情况：显微镜下随机选择6个视野，计数表达有绿色荧光的细胞数占整个视野总数的百分比，重复上述操作3次。5、采用生长曲线法、MTT法分析TGF-β1对细胞生长与增殖的影响。6、使用流式细胞仪测定不同时间点转染细胞凋亡指数的变化、分析细胞周期改变。7、RT-PCR检测pEGFP-TGF-β1转染不同时间点TGF-β1、p21、CDK2mRNA的变化：设立正常组、空染组和转染组，分析其对细胞调控的作用机制。细胞弃培养液，每50ml培养瓶中加入1ml Trizol，按Trizol试剂盒用一步法提取总RNA，用DNA／RNA测定仪测定RNA浓度和纯度。逆转录合成cDNA后，通过PCR反应扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳后EB显色，凝胶自动成像仪进行进行摄像分析。8、Western-blot印记法分析pEGFP-TGF-β1转染对TGF-β1、p21、CDK2蛋白的影响：设立正常组、空染组和转染组，选取不同时间点，提取细胞蛋白质，采用Folin-酚试剂法进行蛋白定量，SOS-PAGE电泳分离后采用半干转印技术进行转印，分别加入第一抗体、第二抗体，洗膜后进行ECL显色。9、RT-PCR、Western-blot印记法检测Smad4mRNA和蛋白，设立正常组、空染组和转染组，选取不同时间点。10、统计学处理：采用SPSS医用软件统计软件包进行统计。结果1、成功构建pEGFP-TGF-β1真核基因载体，完成质粒的筛选、扩增和鉴定。2、脂质体介导的pEGFP-TGF-β1成功转染HLEC-B3，增强型绿色荧光蛋白EGFP在人晶状体细胞中成功表达，荧光显微镜观察，荧光表达明亮均匀，且无明显细胞毒性，是很好的指示蛋白。3、脂质体介导的TGF-β1基因成功转染HLEC-B3，转染率达21％，转染后细胞出现形态学改变，转染组细胞失去正常形态；细胞变圆、脱壁、继而伸长，直至大部分漂浮死亡。4、pEGFP-TGF-β1转染后24～96h细胞的增殖受到明显抑制，与相应对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)。5、转染细胞凋亡比率[转染24h为20.98±1.73％，转染48h至43.61±1.39％]明显升高，与相应对照组[正常细胞组：0.42±0.06％，0.63±0.02％]比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)；细胞出现G1期阻滞现象，表现为G1期细胞比例[转染24h为72.01±1.88％，转染48h为74.73±2.22％]增加，S期细胞比例[转染24h为20.45±2.24％，转染48h为19.37±1.42％]下降，与相应对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)。6、RT-PCR检测TGF-β1mRNA：转染组24h开始升高，48h达到高峰，然后逐渐下降，96h接近正常，空染组和正常组无明显变化，p21变化趋势与其大致相同，CDK2正好相反。7、Western-blot检测TGF-β1、p21和CDK2蛋白水平各组结果和RT-PCR结果趋势大致相同。8、RT-PCR、Western-blot检测Smad4水平，24h开始升高，48h达到高峰，72h明显下降，96h接近正常。结论1、pEGFP-TGF-β1可成功转染HLEC-B3，EGFP在人晶状体上皮细胞中均匀表达，并无明显细胞毒性作用，可以作为良好的标记蛋白。2、TGF-β1诱发人晶状体上皮细胞G1期阻滞，使细胞停滞在G1／S期，诱导细胞凋亡，从而有效抑制细胞增殖。3、TGF-β1通过启动凋亡基因P21，下调CDK2，影响细胞周期调控，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖。4、TGF-β1通过TGF-β／Smad途径作用于晶状体上皮细胞，调控细胞的增殖和分化。