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背景三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）不仅是体内储能供能物质,还是细胞间传递信息的重要活性递质。缺血缺氧、炎症损伤、再灌注损伤后,受损细胞释放大量ATP。而胞外高浓度的ATP（mmol/L水平）可选择性的作用于嘌呤受体,特别是P2X7受体,通过调节包括p38、ERK、JNK、PKC、NF-кB等胞内的信号分子诱导免疫细胞的活化,引起大量炎性介质的释放,而炎性介质的释放又可以激活更多的免疫细胞,最终导致周围神经元的继发性死亡。大量的体外实验和动物在体实验证实一定浓度范围内H2S对缺血缺氧和化学性等细胞损伤具有保护作用,并陆续在神经系统和心血管系统中得到证实。而ATP–P2X嘌呤信号通路在H2S脑神经保护中的作用却鲜有报道,对P2X嘌呤受体后的胞内信号通路并不明晰。本实验旨在研究H2S对ATP诱导小胶质细胞活化的影响,探讨胞内信号途径MAPK在其中的作用,并试图发现H2S神经保护作用关键作用靶点。目的观察H2S对ATP诱导的小胶质细胞存活率、炎性细胞因子释放、MAPK蛋白表达和条件培养基对神经元样细胞的影响,探讨H2S保护ATP诱导的神经元样细胞损伤的作用及机制。方法1 NaHS对ATP诱导的小胶质细胞存活率的影响1.1 ATP对小胶质细胞存活率的影响含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养大鼠小胶质细胞。实验取对数期分化良好的细胞,吹打均匀,以1x105/L的细胞密度接种于96孔培养板中,37℃,5%CO2培养24h,随机分为6组:（1）正常对照组:大鼠小胶质细胞常规培养,不予任何药物处理。（2）ATP组（分组用0.3mmol/L、1mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L、7 mmol/L ATP）。不同浓度的ATP诱导大鼠小胶质细胞6h,MTT法检测各组细胞存活率,正常对照组存活率定为100%。1.2 NaHS对ATP诱导的小胶质细胞存活率下降的影响细胞处理方法同1.1,随机分为6组,正常对照组、ATP组、NaHS（50、100、200、800μmol/L）+ATP组。不同浓度的NaHS预孵育30min后再加入3mmol/L ATP处理6h,并且NaHS始终存在于反应体系中。MTT法检测各组细胞存活率,正常对照组存活率定为100%。1.3 NaHS和KN-62影响ATP诱导小胶质细胞存活率的比较细胞处理方法同1.1,随机分为4组,正常对照组、ATP组、KN-62（P2X7受体拮抗剂）+ATP组、NaHS+ATP组。其中ATP为3mmol/L,KN-62为500nmmol/L,NaHS为200μmol/L。KN-62或NaHS预孵育30min后,同时加入ATP处理6h,并且NaHS和KN-62始终存在于反应体系中。MTT法检测各组细胞存活率,正常对照组存活率定为100%。2 NaHS对ATP活化的大鼠小胶质细胞TNF-α、IL-6释放的影响对数期分化良好的大鼠小胶质细胞吹打均匀接种于35mm培养皿中,随机分为4组:正常对照组、ATP组、KN-62+ATP组、NaHS+ATP组。其中ATP为3mmol/L,KN-62为500nmmol/L,NaHS为200μmol/L。KN-62、NaHS预孵育30min后加入ATP作用12h,收集各组细胞上清液,离心后依照ELISA试剂盒说明书操作,检测各组细胞上清液中TNF-α、IL-6的含量。3 ATP、NaHS处理小胶质细胞获得的条件培养基（condition medium,CM）对SH-SY5Y神经元样细胞的影响药物处理或不处理大鼠小胶质细胞得到的培养液,离心后的上清液即条件培养基。SH-SY5Y细胞处理方法同1.1,吹打均匀后接种于35mm培养皿及96孔培养板,培养24h。培养皿内细胞随机分为4组:（1）正常对照组:常规培养12h的大鼠小胶质细胞培养液离心后替换SH-SY5Y原培养液,继续培养。（2）ATP组:取处理12h的小胶质细胞上清液离心并替换SH-SY5Y原培养液,继续培养。（3）KN-62+ATP组:KN-62预孵育30min,余同ATP组,并且KN-62始终存在于反应体系中（4）NaHS+ATP组:NaHS预孵育30min,余同ATP组,并且NaHS始终存在于反应体系中。其中ATP为5mmol/L,KN-62为500nmmol/L,NaHS为200μmol/L。不同时间梯度倒置显微镜下观察SH-SY5Y细胞形态变化、脱壁情况。MTT检测细胞存活率,正常对照组存活率定为100%。4 NaHS对ATP诱导的大鼠小胶质细胞MAPK蛋白表达的影响对数期分化良好的大鼠小胶质细胞吹打均匀接种于35mm培养皿中,随机分为4组:正常对照组、ATP（3mmol/L）组、KN-62（500nmmol/L）+ATP组、NaHS（200μmol/L）+ATP组。药物处理顺序同1.3。全部药物处理结束后,收集细胞。Western blotting检测各组细胞内ERK、p-ERK、P38、p-P38、JNK、p-JNK蛋白水平变化。结果1 NaHS对ATP诱导的小胶质细胞存活率的影响1.1不同浓度的ATP对大鼠小胶质细胞存活率的影响以正常对照组细胞存活率为100%,0.3mmol/L ATP组细胞存活率分别为97.06±1.96%,与对照组无明显差异（P>0.05）。但1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、7mmol/LATP组细胞存活率分别为87.32±2.96%、82.66±3.01%、77.95±4.99%、73.27±2.32%,都明显低于对照组,均有统计学意义（P<0.01）。表明ATP诱导的大鼠小胶质细胞损伤具有浓度依赖性,1mmol/L ATP已然表现出损伤作用。1.2不同浓度的NaHS对ATP诱导的大鼠小胶质细胞存活率的影响分别给予50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、800μmol/L NaHS预孵育30min后,再加入3mmol/L ATP处理6h。以正常对照组细胞存活率为100%,ATP组细胞存活率为82.66±3.01%,ATP处理前用50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、800μmol/L NaHS预孵育,细胞存活率分别为85.71±2.97%、91.49±4.97%、94.54±5.12%、69.64±6.02%,其中200μmol/L NaHS预孵育细胞存活率明显高于单纯ATP组（P<0.01）,表明NaHS对ATP诱导的大鼠小胶质细胞损伤的保护作用具有浓度依赖性,最佳浓度为200μmol/L,而高浓度（800μmol/L）的NaHS反而表现出对细胞的毒性作用（P<0.01）。1.3 NaHS与KN-62对ATP诱导的大鼠小胶质细胞存活率的影响分别给予200μmol/L NaHS、500nmol/L KN-62预孵育30min后,加入3mmol/L ATP处理6h。以正常对照组细胞存活率为100%,单纯ATP组细胞存活率为82.66±3.01%,明显低于对照组（P<0.01）,而NaHS+ATP、KN-62+ATP组细胞存活率分别为94.54±3.96%、93.68±2.98%,均高于单纯ATP组,具有统计学意义（P<0.01）。以上结果提示NaHS具有类KN-62作用,能够减少ATP引起的细胞死亡,提高小胶质细胞存活率,提示P2X7受体可能是二者共同的作用位点之一。2 NaHS对ATP活化的大鼠小胶质细胞TNF-α、IL-6释放的影响ELISA检测细胞上清液中TNF-α、IL-6水平来反应大鼠小胶质细胞的活化。结果显示,ATP处理24后胞外TNF-α、IL-6释放量较正常对照组分别增加114.68±2.00%（P<0.01）和76.11±1.97%（P<0.01）;而给予P2X7R特异性阻断剂KN-62预孵育30min再加入ATP处理,二者释放量较ATP组减少了34.32±3.01%（P<0.05）和21.44±2.95%（P<0.05）;同样NaHS预处理也可降低ATP的活化效应,使二者释放量减少了36.00±4.03%（P<0.05）和17.89±3.99%（P<0.05）。表明KN-62可以阻断ATP引起的促炎细胞因子释放,提示P2X7R在ATP诱导的促炎介质释放中起着重要作用。而NaHS亦可降低ATP引起的促炎细胞因子释放,提示P2X7受体可能是H2S的一个作用靶点。3条件培养基（condition medium,CM）对SH-SY5Y神经元样细胞的影响3.1条件培养基引起的SH-SY5Y细胞形态变化分别用ATP、KN-62+ATP、NaHS+ATP处理大鼠小胶质细胞后,必然会不同程度地释放一些促炎因子。收集含有促炎因子的培养液（条件培养基）来处理SH-SY5Y细胞。倒置显微镜下正常SH-SY5Y细胞大部分呈梭形、三角形,少数呈多边形,立体感强。细胞有突起,胞浆内有较多颗粒,贴壁能力强。在ATP（5mmol/L）条件培养基作用下,随着作用时间的延长,细胞开始出现突起长度变短,胞体变圆,体积皱缩,脱壁增加,显示出细胞毒性作用。结果提示ATP处理小胶质细胞可释放细胞毒性因子。但NaHS和KN-62条件培养基能够使细胞损伤表现减轻,脱壁细胞数量减少。NaHS能够减少ATP处理的小胶质细胞释放的细胞毒性因子,提示小胶质细胞活化可能是H2S神经元保护作用的关键环节。3.2条件培养基对SH-SY5Y细胞存活率的影响分别给予KN-62、NaHS预孵育大鼠小胶质细胞30min后,加入5mmol/L ATP,并且KN-62、NaHS始终存在于反应体系中。继续培养12h,取上清液离心并替换原SH-SY5Y细胞培养液,继续培养48小时。以正常对照组细胞存活率为100%,ATP组细胞存活率为50.41±2.31%,较正常对照组明显降低（P<0.01）。KN-62+ATP组细胞存活率为63.01±3.02%,NaHS+ATP组细胞存活率为65.48±4.06%,二者存活率均高于单纯ATP组,具有统计学意义（P<0.05）。以上结果表明H2S和KN-62,均可减轻ATP条件培养基诱导的SH-SY5Y细胞损伤,具有神经元保护作用。4 NaHS对ATP诱导的大鼠小胶质细胞MAPK蛋白表达的影响Western blotting结果显示,3mmol/L ATP处理1h后,大鼠小胶质细胞的p-P38、p-JNK蛋白表达明显增加,分别比正常对照组增加了168.05±3.00%（P<0.01）、148.40±2.03%（P<0.01）,而p-ERK1/2则无明显变化（P>0.05）。KN-62孵育30min后再用ATP处理,p-P38、p-JNK蛋白表达较ATP组分别降低了54.04±4.87%（P<0.01）、24.69±2.89%（P<0.05）。同样NaHS预处理,p-P38、p-JNK蛋白分别下降57.46±1.95%（P<0.01）、31.84±2.92%（P<0.05）。KN-62和NaHS均未使p-ERK1/2明显变化（P>0.05）。上述结果进一步表明NaHS具有类似于KN-62的作用,可以下调ATP诱导的小胶质细胞磷酸化蛋白表达。H2S抑制ATP诱导的小胶质细胞活化可能主要与胞内p38和JNK MAPK信号途径有关,而与ERK1/2的关系不大。结论（1）胞外高浓度ATP作用于P2X7受体激活P38、JNK MAPK信号通路诱导大鼠小胶质细胞的活化。（2）大鼠小胶质细胞活化后释放TNF-α、IL-6增加,降低SH-SY5Y神经元样细胞存活率。（3）H2S调节ATP-P2X7R-MAPK通路,抑制小胶质细胞的活化起神经保护作用。