牙周病治疗的目标是促使受损组织不同程度的修复和再生,如何获得牙周组织结构和功能的完全性再生,一直是国内外学者追求的目标和研究的方向。近年来,牙周组织再生的研究取得了重要进展。理想的牙周组织再生,应同时包括牙骨质、牙周膜和牙槽骨的再生。其关键是选择合适的干细胞作为牙周组织工程的种子细胞。牙囊起源于外胚间充质,是包绕在成釉器周围的疏松结缔组织,在牙齿发育后期和牙齿的萌出中均发挥着重要作用,是形成牙周组织的唯一器官。牙囊细胞在牙周组织分化发育中的特点,使其成为一种值得考虑的种子细胞。牙囊细胞是牙周组织发育的直接前体细胞,成纤维细胞、成牙骨质细胞以及成骨细胞都由其分化而来,在牙齿发育后期形成牙周膜、牙骨质及固有牙槽骨。牙囊细胞具有形成牙周组织各部分的能力,能够在短时间内向多个方向分化,这可能与牙囊细胞自身生物学特性有关。牙囊细胞为一类异质性细胞群,可能含有牙周发育的前体细胞成分,具有向特定方向分化的能力。此外,牙囊细胞在临床上取材方便,可以从丢弃的牙囊组织中获得。以上均提示牙囊细胞可以作为候选种子细胞应用于牙周组织工程。因此,本研究从牙囊细胞的生物学特性及分化特点等方面着手进行研究,通过筛选单细胞衍生的牙囊细胞克隆并对其进行克隆表型分析,更深入地认识这种存在于牙周发育时期的前体细胞,探讨其作为种子细胞应用于牙周组织工程的可行性,指导以牙囊细胞为种子细胞的牙周组织再生工程的构建,为今后的实验研究以及临床应用奠定基础。课题研究的主要内容和结果如下:第一部分:牙囊干细胞的分离和生物学特性研究目的:验证牙囊干细胞作为牙周组织工程种子细胞的可行性。方法:本实验分离培养了人牙囊干细胞,行体外生物学特性检测,并以人骨髓间充质干细胞为对照,进行干细胞生物学相关性状比较。结果:两种细胞均为成纤维细胞样细胞群,牙囊细胞胞体稍短,骨髓间充质干细胞胞体则较为细长;两种细胞的CD34、CD45(造血系细胞标志)表达均呈阴性; CD29、CD44、CD90、CD105(间充质细胞标志)均呈高表达;相对于骨髓间充质干细胞,牙囊干细胞的Stro-1 (间充质干细胞特异性标志物,在未分化细胞群中高表达)表达、增值活性及克隆形成率均较高;成骨向分化能力没有显著性差异;成脂向分化能力较低。结论:牙囊干细胞同骨髓间充质干细胞一样,在体外均呈现较强的干细胞特性-增殖活性、克隆形成能力、多向分化能力;两者均来自外胚间充质细胞;相对于骨髓间充质干细胞,牙囊干细胞中含有更多的未分化细胞。牙囊干细胞可以作为优选种子细胞应用于牙周再生组织工程。第二部分:牙囊细胞异质性研究目的:研究牙囊细胞异质性。方法:采用有限稀释铺板法筛选单细胞衍生的牙囊细胞克隆,通过克隆表型分析,观察不同克隆表型牙囊细胞的生物学特性及其牙周组织再生能力。结果:通过有限稀释方法可以获得单细胞衍生的牙囊细胞克隆;不同克隆表型之间的生物学特性存在较大差异;根据各个克隆的表型分析大致可以分为未分化型、成纤维型和成骨/牙骨质型三种表型,并相应在体内异位形成特有的结构。结论:牙囊细胞为异质性细胞群,不同表型的牙囊细胞克隆具有形成特定牙周组织结构的潜力。利用这一特性,我们可以根据需要获得某种特定结构,也可以将不同表型的克隆重组以构建具有完整生物活性的牙周组织结构,这在理论上是可行的。