第一部分MPPa-PDT介导乳腺癌细胞周期阻滞的研究乳腺癌是女性常见的十大恶性肿瘤之一。近年来,我国乳腺癌的发病率在逐年增长,而且年轻患者所占的比例也在增加。但是,乳腺癌的发病原因还没能够被彻底的研究清楚。对于高发病年龄段的人群,我们也还没有发现可以有效预防乳腺癌发生的有效措施。对于已确诊的乳腺癌患者,在其治疗过程中也尚未能理想地控制其复发和转移。因此,高质量的科学研究结果对于乳腺癌患者的治疗具有至关重要的作用。光动力治疗是在上世纪七十年代产生的一种肿瘤治疗技术,它以光敏剂来介导治疗,恶性组织会选择性地吸收光敏剂。用特定波长的光激发光敏剂,光敏剂被激发后获得能量,被激发的光敏剂可把获得的能量传递给周围的氧分子,通过一系列能量转换过程,最终产生大量的具有极高反应活性的活性氧族,从而导致细胞死亡。光敏剂作用于靶组织的方式有多种,可以将光敏剂直接涂抹在肿瘤表面,也可通过局部注射使光敏剂进入肿瘤组织内,或者是通过静脉注射的方式使光敏剂先进入血液循环,由于肿瘤组织可以选择性吸收光敏剂而使得光敏剂浓集于肿瘤组织内。目前,大多数光动力治疗中所使用的光敏剂都有一个类似于叶绿素或血红蛋白杂环结构。焦脱镁叶绿酸-a甲酯(Methyl pyropheophorbide-a, MPPa)是一种有效的新型光敏剂,它是叶绿素的衍生物。细胞对外部刺激的反应多种多样,包括细胞增殖、分化、死亡以及细胞调节等。虽然细胞的增殖和死亡是细胞对外界刺激的两种截然不同的反应,但是在这两种不同的生物反应过程中也有一些相似的形态学和生物化学改变。细胞周期调控是决定细胞是发生增殖还是凋亡的双向开关。不同的物理和化学刺激可以引起不同的细胞损伤,并且细胞修复受损的能力在不同时期也是不一样的。研究表明,凋亡可以发生在细胞周期阻滞的不同阶段。细胞凋亡和细胞周期控制机制之间存在一定的联系。细胞周期检测点可以确保在细胞周期不同时期DNA复制和染色体分布的质量。控制细胞周期检测点可以导致细胞凋亡的发生。[实验目的]通过检测经过光动力治疗后MDA-MB-231细胞发生的细胞周期阻滞以及细胞周期相关蛋白CHK2、P21、CyclinDl的变化,以进一步了解MPPa-PDT作用于乳腺癌细胞系MDA-MB-231的作用机制。[实验方法]1.将MDA-MB-231细胞分成四组,除对照组外,对其余三组进行相同MPPa浓度,不同照光剂量的处理。2.流式细胞仪检测细胞周期阻滞。3. Western blot检测细胞内细胞周期相关蛋白CHK2, P21, CyclinDl的表达水平变化情况。[实验结果]1.流式细胞仪检测结果表明,光动力治疗后的细胞凋亡率约为46%；与对照组相比,S期的细胞数目明显增加。2. Western blot检测结果：经过光动力治疗后细胞内细胞周期蛋白D1的表达量下降显著,而CHK2和P21的表达量明显增加。[结论]1. MPPa介导的光动力治疗所诱导细胞周期阻滞发生在S期。2.光动力疗法可以抑制MDA-MB-231细胞的增殖。3. MPPa介导的光动力治疗可通过正向调节细胞周期蛋白D1的表达和负向调节Chk2和P21的表达来诱导细胞凋亡。第二部分MPPa-PDT联合HSV1-TK治疗前列腺癌的研究肿瘤的自杀基因治疗(也即药物敏感基因治疗),指的是将某些细菌或者病毒的基因导入肿瘤细胞内,自杀基因编码的酶类物质可将药物转化成毒性物质,后者可杀灭肿瘤细胞。更昔洛韦(Ganciclovir, GCV),是鸟嘌呤核苷酸的衍生物。GCV在HSV1-TK作用下发生磷酸化,转变成单磷酸盐,再经细胞激酶(内源性)的作用,可转化为二磷酸盐和三磷酸盐,GCV的二磷酸盐和三磷酸盐对处于增殖过程中的哺乳动物细胞有很强的毒性作用。糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein 78, GRP78)在乳腺癌、脑部肿瘤、胃癌、前列腺癌等多种肿瘤组织中表达水平明显增高。GRP78可以激活HSV1-TK的表达,以消除肿瘤细胞。焦脱镁叶绿酸-a甲酯是叶绿素的衍生物,这种新型光敏剂易于在前列腺癌PC-3细胞中富集并可以通过光动力作用杀伤癌细胞,而对正常细胞基本无杀伤作用。[实验目的]将MPPa-PDT光动力治疗与HSV1-TK基因疗法联合应用,PC-3中活跃的GRP78启动子可以启动转染入PC-3的自杀基因HSV1-TK大量表达,因而将药物前体更昔洛韦转化为磷酸盐的形式,GCV磷酸盐对肿瘤细胞DNA的合成产生抑制作用从而杀伤肿瘤细胞。该治疗同时联合MPPa-PDT,以明确两种治疗方法联用可以增加治疗效果。[实验方法]1.在Gen-Bank中检索HSV1-TK 的mRNA,设计上下游引物,进行PCR扩增,以获取目的基因。2.构建HSV1-TK表达载体GV230-TK,然后取部分重组质粒测序鉴定一下质粒构建是否成功。3.将重组质粒通过脂质体法转染前列腺癌细胞株PC-3。质粒GV230-TK含有绿色荧光蛋白基因,转染肿瘤细胞后在荧光显微镜下可观察到有明亮的绿色荧光,以直观明确转染效率。收集细胞蛋白进行Western Blot检测来明确HSV1-TK基因是否成功转染并表达。4.将待处理细胞分为四组：HSV1-TK/GCV+MPPa-PDT联合治疗组,单纯MPPa-PDT治疗组,单纯HSV1-TK/GCV治疗组及对照组。5.CCK-8实验来测定四个组细胞的存活率状况。6.用流式细胞仪检测分析各组细胞的凋亡情况。[实验结果]1.CCK-8实验结果显示,单纯HSV1-TK/GCV治疗组相比对照组细胞存活率降低,单纯MPPa-PDT治疗组相比对照组细胞存活率下降,HSV1-TK/GCV+MPPa-PDT联合治疗组均比其它三组细胞存活率下降更加明显。联合治疗组比其它组细胞存活率明显降低。2.流式细胞仪检测结果显示,实验组均出现明显细胞凋亡,联合治疗组比其它组凋亡更加明显。[结论]HSV1-TK/GCV治疗同时联合MPPa-PDT治疗可以增进单纯MPPa-PDT治疗和单纯HSV1-TK/GCV治疗的促凋亡效果,其机制可能与促凋亡而产生增殖抑制作用有关。HSV1-TK基因治疗同时联合MPPa-PDT可以增进前列腺癌的治疗效果。