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为了研究NS3蛋白与CSFV致CPE的关系,探索CSFV对猪专一性致病机理,需要研制出NS3蛋白的单克隆抗体,来检测CSFV感染后NS3蛋白在发生CPE的细胞与其他不发生CPE的细胞中的表达差异以及将NS3基因转入猪细胞中时NS3蛋白的表达情况,并根据细胞发生CPE或凋亡的情况,来判定NS3蛋白与猪细胞发生CPE或凋亡的关系,这些探索对于进一步揭示CSFV致细胞病变的机制将有重大意义。本研究由两部分构成,第一部分是将猪瘟病毒石门株NS3基因在原核细胞中得到表达,利用镍柱亲和层析将重组蛋白纯化,并以纯化的重组蛋白为抗原免疫小鼠,诱导小鼠产生了抗NS3蛋白的抗体。第二部分是将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,经筛选和克隆获得了稳定分泌抗CSFV NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,小鼠体内诱生法制腹水,并对杂交瘤细胞株及单克隆抗体的特性进行了一系列鉴定。1.本试验采用PCR技术扩增了猪瘟病毒石门株NS3基因,并将其丝氨酸蛋白酶功能片段克隆到原核表达载体pET-32a中,应用双酶切和序列测定对其进行鉴定,结果表明,基因插入方向、大小、位置、读码框及核苷酸序列均正确,得到了重组载体pET - NS3。将构建好的原核表达载体在大肠杆菌Rosetta中进行了表达,对表达产物进行了SDS- PAGE分析以及Western blot检测,结果表明该重组蛋白大小约为43ku,与预期结果一致,而且该重组蛋白能被猪瘟阳性血清所识别,具有良好的反应原性。利用镍柱亲和层析对表达的重组蛋白进行纯化,经SDS-PAGE及薄层扫描分析表明,重组蛋白的纯度在90%以上;经紫外线吸收法检测表明,重组蛋白的浓度约为0.5 mg/mL。以纯化的重组NS3蛋白免疫小鼠,ELISA检测表明成功诱导小鼠产生了抗NS3蛋白的抗体,为下一步制备抗NS3蛋白的单克隆抗体提供了必要的物质基础。同时此纯化的重组NS3蛋白也为猪瘟野毒感染与E2亚单位疫苗免疫的鉴别诊断提供了依据。2.取尾静脉加强免疫后的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选及3次连续克隆化,获得了4株可稳定分泌抗猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞(2G7,2F11,5D2和6F11),小鼠体内诱生法制腹水。对杂交瘤细胞株及其上清单抗与腹水单抗的特性进行了一系列鉴定。结果显示,杂交瘤细胞株冻存复苏及传代后仍能稳定分泌单抗,细胞染色体检查正常,单抗效价高,亲和力不一,Ig亚类鉴定均为IgG1。Western blot分析证明4株单抗均能与原核表达的NS3蛋白特异结合,6F11株与真核表达的NS3蛋白有较强的特异性反应。本研究成功制备了抗猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体,为深入研究NS3蛋白在猪瘟病毒致细胞病变中的作用奠定了基础。