研究背景和目的：结直肠癌(colorectal cancer)是我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一,在西方国家发病率和死亡率居肿瘤的第三位。近几年,我国的结直肠癌的发病率呈明显上升趋势。结直肠癌发生发展是多因素、多步骤、多基因参与的复杂过程,发病早期,经过手术治疗90%的病人可被治愈,然而临床上约40%-50%的结直肠癌患者在确诊时已出现了微转移。结直肠癌的局部转移一般早于远处转移,约60%-80%的患者在术后2年内出现局部转移,转移是导致患者死亡的重要原因。结直肠癌严重影响患者的生活质量和寿命,同时也给患者和社会带来沉重的经济负担。目前,尽管对其已有了大量的研究与报道,但是迄今为止,结直肠癌的形成及转移的分子基础和机制尚不完全清楚。结直肠癌的发生是在多种致瘤因素的作用下,肠粘膜上皮细胞在基因水平失去了对其生长的正常调控,导致细胞周期紊乱,肠粘膜上皮细胞出现无限增殖,最终导致癌症的发生。结直肠癌的转移是一个多步骤、多阶段、多基因参与的复杂过程,包括癌细胞从肿瘤的原发部位逃脱,进入周围的基质,进而进入循环系统或淋巴系统,粘附在内皮细胞壁的肿瘤细胞向血管外迁移,在远处浸润、血管增生最终形成新的转移灶。该过程伴有多个基因的突变,其中包括众多癌基因的激活。目前已报道有数百种基因参与结直肠癌转移过程,而且数目仍在继续增加。鉴于此,深入研究结直肠癌的发生发展的分子机制,在众多的因素中寻找有效、敏感的、特异的结直肠癌转移分子标志物,从而对结直肠癌转移进行预警、诊断、干预以及预后判断具有重要的临床价值和社会效益。LIM激酶1(LIM Kinase 1,LIMK-1)基因是我们前期通过表达谱芯片筛选出来的一个在发生淋巴结转移的结直肠癌组织中表达上调的基因。LIMK-1基因位于人类染色体7q11.23,含有39499个碱基,具有16个外显子,该基因产生信使mRNA,可编码全长LIMK-1蛋白。LIMK-1公认的作用是磷酸化ADF/cofilin的第3位丝氨酸(Ser3)而使其失活,继而抑制F-actin形成G-acting,抑制Cofilin的引起的肌动蛋白解聚作用,参与肌动蛋白细胞骨架的重组,激动蛋白的聚合可形成伪足结构,从而调节细胞的运动和迁移,驱动肿瘤细胞迁移。近年来研究发现,LIMK-1蛋白不但在细胞骨架重组调控方面起着重要作用,还能够介导膜结构中的肌动蛋白动态组装和拆卸,如板状伪足和丝状伪足的形成,被认为是细胞运动的基础,引起细胞的迁移和入侵。研究报道LIMK-1在乳腺癌和前列腺癌等多种恶性肿瘤中高表达,并和肿瘤发生、侵袭和转移密切相关。然而,LIMK-1在结直肠癌发生发展中的作用及分子机制亦知之甚少。本课题拟检测LIMK-1在结直肠癌中的表达情况,分析其表达与相关临床病理参数之间的关系;通过体内外实验,研究LIMK-1在结直肠癌发生、发展和转移过程中的作用和相关的分子机制。方法：1.组织基因芯片分析LIMK-1为淋巴结转移与非淋巴结转移的结直肠癌中的差异表达基因；2.免疫组织化学(IHC)、免疫印迹(western blot)和免疫荧光(immunofluorescence)检测结直肠癌石蜡样本和新鲜组织样本中LIMK-1的表达,并分析LIMK-1的表达定位与肿瘤分期、转移和临床预后等相关临床病理参数的关系；3.引入核定位、核输出信号,构建LIMK-1胞浆、胞核亚细胞定位表达载体,合成siRNA干扰LIMK-1的表达,通过瞬时转染结直肠癌细胞株,在体外利用CCK8、transwell、划痕实验等分别检测瞬时过表达及干扰LIMK-1对结直肠癌细胞增殖及迁移能力的影响；4.建立LIMK-1胞浆、胞核亚细胞定位稳定过表达的结直肠癌细胞株,在体外通过CCK8、transwell实验检测细胞的增殖及迁移能力；在体内通过裸鼠皮下成瘤实验检测细胞的生长能力,裸鼠尾静脉注射实验检测细胞的肺定植能力；5.利用western blot检测LIMK-1瞬时过表达后信号通路的激活情况、EMT标志物表达的变化；6.利用带HA抗体的Agroase筛选LIMK1相互作用的蛋白,质谱鉴定差异条带,利用免疫共沉淀技术(Co-immunoprecipitation)及免疫荧光验证候选蛋白与LIMK-1的相互作用。结果：1.LIMK-1E结直肠癌组织及细胞中表达水平的检测1)基因芯片分析淋巴结转移及无淋巴结转移的结直肠癌LIMK-1的表达我们分别对八例淋巴结转移及无淋巴结转移的结直肠癌样本进行基因芯片检测,分析芯片结果从中选取了结直肠癌淋巴结转移组及无淋巴结转移组中表达具有2倍差异(p<0.05)的LIMK-1作为后续候选基因。查阅文献,LIMK-1在结直肠癌中未见报道。2) 结直肠癌组织中LIMK-1的表达IHC实验表明LIMK-1阳性表达主要定位于细胞质和细胞核中,正常结直肠组织中LIMK-1蛋白表达水平低于相配对的肿瘤组织,LIMK-1蛋白在结直肠癌组织细胞浆过表达率17.7%(27/152)高于正常结直肠组织细胞浆过表达率0%(0/78)(p=0.000)；结直肠癌组织细胞核过表达率57.9%(88/152)高于正常结直肠组织细胞核过表达率17.9%(14/78) (p=0.000);western blot实验结果也显示正常结直肠组织中的LIMK-1蛋白表达水平低于相配对的肿瘤组织(p=0.0151)；组织免疫荧光结果显示LIMK-1蛋白在正常组织中的表达水平较低,主要表达于组织的细胞浆;在癌组织中表达水平较高,主要表达于细胞浆与细胞核中。3)结直肠癌细胞系中LIMK-1在的表达western blot结果显示人结直肠癌细胞株中LIMK-1蛋白在淋巴结转移灶来源的LOVO、SW620及肝转移亚系M5中高表达,在转移潜能相对低的HCT116、 LS174T、SW480和HT29细胞系中表达相对较低；免疫荧光结果显示,在转移潜能相对低的HCT116、LS174T、SW480和HT29细胞系中表达相对较低,主要定位于细胞浆,在淋巴结转移灶来源的LOVO、SW620细胞系中表达相对较高,阳性定位于细胞浆及细胞核。4) LIMK-1的表达和临床病理参数之间的关系LIMK-1的表达水平与年龄组、性别肿瘤大小和肿瘤分化没有显著差异(P>0.05);LIMK-1的表达与结直肠癌TNM分期相关,其中随着结直肠癌细胞浸润深度(T)增加LIMK-1的表达无显著差异(P>0.05),但随着淋巴结转移(N)发生,淋巴结转移组(N1+N2)胞浆内LIMK-1过表达率高于无淋巴结转移组(NO)胞浆内过表达率(P=0.007),淋巴结转移组(N1+N2)胞核内LIMK-1过表达率高于无淋巴结转移组(NO组)胞核内过表达率(P=0.000),并且随着远处转移(M)发生,远处转移组(M1)胞浆内LIMK-1过表达率高于无远处转移组(M0)胞浆内过表达率(P=0.029),远处转移组(M1组)胞核内LIMK-1过表达率高于无远处转移组(M0)胞核内过表达率(P<0.05)；复发组LIMK-1胞浆过表达率高于未复发组胞浆内过表达率(P=0.049),复发组LIMK-1胞核过表达率高于未复发组胞核内过表达率(P=0.000)。5) LIMK-1的表达水平与患者临床预后的相关分析Kaplan-Meier法生存分析结果显示,LIMK-1胞浆、胞核内过表达的结直肠癌患者总体生存率显著低于低表达组,统计学上有显著差异(Log-Rank,P<0.05); LIMK-1胞浆、胞核内过表达的T3+T4和NO分期结直肠癌患者的总体生存率显著低于低表达组,统计学上有显著差异(Log-Rank,P<0.05)。6)影响CRC患者预后的单因素与多因素分析单因素分析提示LIMK-1胞浆、胞核过表达与结直肠癌预后的相关,然而,目前逐步回归分析的研究结果表明,LIMK-1的胞浆、胞核过表达并不能作为预测患者不良预后的独立指标(p>0.05)。2.LIMK-1的不同亚细胞定位对结直肠癌生物学特性的影响1)LIMK-1瞬时过表达对结直肠癌细胞增殖和侵袭的影响① LIMK-1瞬时过表达效果验证我们引入核定位、核输出信号,合成构建了LIMK-1胞浆、胞核亚细胞定位表达载体(HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK-1、HA-LIMK1)及空白对照组载体(HA),瞬时转染内源性低表达LIMK-1的SW480、HCT116细胞,western blot检测HA-LIMK1融合蛋白表达。结果表明转染HA-LIMK-1、 HA-NES-LIMK-1、HA-NLS-LIMK-1细胞能表达HA-LIMK1融合蛋白。②LIMK-1瞬时过表达对结直肠癌细胞增殖能力的影响CCK8实验结果显示,在SW480和HCT116细胞中,瞬时过表达LIMK-1的细胞(HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMKl)与对照组(HA)相比的生长速度显著上升,组别和时间存在交互效应,差异具有统计学意义(SW480, F=33.025, p<0.001; HCT116, F=55.276, p<0.001)。结果表明,LIMK-1的瞬时过表达在体外能够促进结直肠癌细胞的增殖。③ LIMK-1瞬时过表达对结直肠癌细胞迁移能力的影响Transwell细胞迁移实验结果显示,在SW480和HCT116细胞中,瞬时过表达LIMK-1的细胞株(HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMKl)与对照组(HA)相比迁移细胞的数量明显增多(P=0.000)；划痕实验结果显示,瞬时过表达LIMK-1的细胞株(HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1)与对照组(HA)相比迁移率明显增加(P=0.000)。上述实验结果表明,LIMK-1的过表达在体外能够增强结直肠癌细胞的侵袭迁移能力。2) LIMK-1瞬时沉默对结直肠癌细胞增殖和侵袭的影响①LIMK-1瞬时沉默效率验证将阴性对照末端用带绿色荧光的荧光标记物进行转染效率评价结果显示：siRNA oligo的转染效率可达90%,具有较高的转染效率,便于达到较好的基因沉默效果；将siRNA-377,siRNA-391,siRNA-1782片段分别转染内源性高表达LIMK-1的SW620细胞,western blot结果显示：转染siRNA-377,siRNA-391两个干扰片段的细胞LIMK-1蛋白的表达水平明显下降,表明该两个干扰片段可以成功敲低LIMK-1的表达。② LIMK-1瞬时沉默对结直肠癌细胞增殖能力的影响CCK8实验结果显示：在SW620细胞中,LIMK-1干扰组(siRNA-377、 siRNA-391)的生长速度显著慢于对照组(NC),组别与时间存在交互效应,差异具有统计学意义(F=22.827,p<0.001)。结果表明,LIMK-1的沉默在体外能够抑制结直肠癌细胞的增殖。③ LIMK-1瞬时沉默对结直肠癌细胞迁移能力的影响Transwell细胞迁移实验结果显示：在SW620细胞中,LIMK-1瞬时干扰组(siRNA-377、siRNA-391)迁移细胞的数量显著少于对照组(NC)(P=0.001)。结果表明,LIMK-1的沉默在体外能够抑制结直肠癌细胞的迁移。3) LIMK-1稳定过表达对结直肠癌细胞增殖和侵袭的影响①稳定过表达LIMK-1细胞株SW480的构建与鉴定将HA空载体和HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1重组表达载体分别转染SW480细胞,G418加压筛选挑取抗性单克隆扩大培养,western blot检测结果表明已成功构建LIMK-1稳定过表达细胞,分别命名为SW480/HA、 SW480/HA-LIMK1、SW480/HA-NLS-LIMK1、SW480/HA-NES-LIMK1;免疫荧光检测结果显示SW480/HA-LIMK1的外源性LIMK-1定位于细胞浆与细胞核内,SW480/HA-NLS-LIMK1的外源性LIMK1定位于细胞核内,SW480/HA-NES-LIMK1的外源性LIMK-1定位于细胞浆内,免疫荧光实验结果表明LIMK-1稳定过表达的细胞株构建成功,NLS核定位信号能够将LIMK-1定位于细胞核,NES核输出信号能够将LIMK-1定位于细胞浆中。② LIMK-1稳定过表达体外实验CCK8实验结果显示,与对照组(SW480/HA)相比稳定过表达LIMK-1的细胞株(SW480/HA-LIMK1、SW480/HA-NLS-LIMK1、 SW480/HA-NES-LIMK1)生长速度显著上升,组别和时间存在交互效应,差异具有统计学意义(F=47.904,P<0.001),实验结果表明LIMK-1在胞浆、胞核亚细胞定位稳定过表达在体外均能够促进结直肠癌细胞的增殖；Transwell细胞迁移实验结果显示,稳定过表达LIMK-1的细胞株(SW480/HA-LIMK1、 SW480/HA-NLS-LIMK1、SW480/HA-NES-LIMK1)与对照组(SW480/HA)相比迁移细胞的数量明显增多(P=0.000),实验结果表明LIMK-1在胞浆、胞核亚细胞定位稳定过表达在体外均能够促进结直肠癌细胞的迁移。③ LIMK-1稳定过表达体内实验裸鼠皮下成瘤实验结果显示,与对照组(SW480/HA)相比稳定过表达LIMK-1的细胞株(SW480/HA-LIMK1、SW480/HA-NLS-LIMK1、 SW480/HA-NES-LIMK1)肿瘤生长速度较快,肿瘤重量较重(P=0.005),体积较大(P=0.017),同时, Ki67的阳性率(80.97%、74.08%、80.61%)显著高于对照组SW480/HA (39.54%) (p=0.000),皮下成瘤实验表明胞浆、胞核亚细胞定位稳定过表达LIMK-1均能促进结直肠癌细胞体内生长和增殖；裸鼠尾静脉注射实验结果表明,稳定过表达LIMK-1的细胞株(SW480/HA-LIMK1, SW480/HA-NLS-LIMK1、SW480/HA-NES-LIMK1)与对照组(SW480/HA)相比肿瘤细胞肺定植能力明显增强,肺脏肿瘤结节数目明显增多(p=0.009),尾静脉注射实验表明胞浆、胞核亚细胞定位稳定过表达LIMK-1均能促进结直肠癌细胞体内肺定植能力。3.LIMK-1调控结直肠癌增殖转移的分子机制1) LIMK-1过表达后AKT信号通路蛋白p-PTEN、p-AKT(473)、p-AKT(308)和AKT表达的影响western blotting检测SW480、HCT116两种结直肠癌细胞,瞬时转染HA、HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1四个质粒后,p-PTEN、p-AKT (473)、p-AKT(308)、AKT的表达。结果显示：SW480和HCT116细胞HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1三个处理组p-PTEN的表达较HA对照组表达低,HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1三个处理组p-AKT (473)、p-AKT(308)的表达较HA对照组高,AKT总蛋白量在4种处理细胞间无显著差异,结果表明细胞浆与细胞核内的LIMK-1均可以调控AKT信号通路的活性。2) LIMK-1后对CRC细胞EMT相关分子标志物表达的影响western blot检测SW480、HCT116两种结直肠癌细胞,瞬时转染HA、HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1四个质粒后,EMT相关分子标志物的变化。结果显示：SW480和HCT116细胞HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、 HA-NES-LIMK1三个处理组上皮标志物(E-cadherin、β-catenin)的表达较HA对照组表达量低;HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1三个处理组间叶标志物(N-cadherin、Fibronectin)的表达较HA对照组表达量高。以上结果表明,细胞浆与细胞核中的LIMK-1均可诱导结直肠癌细胞发生EMT转化。3) LIMK-1相互作用蛋白的筛选采用带HA标签抗体的Agarose亲和带HA标签的LIMK-1融合蛋白,结合的总蛋白经SDS-PAGE电泳分离。实验组为SW480/HA-NES-LIMK1、 SW480/HA-NLS-LIMK1、SW480/HA-LIMK1,对照组为SW480/HA。经SDS-PAGE电泳分离,质谱兼容银染后可见清晰蛋白条带,分析得到多条差异蛋白条带,初步筛选鉴定为MYH9(myosin-9,肌球蛋白重链9)、ACTN4(alpha-actinin4,细胞辅助动力蛋白)、DBN1(Drebrin)。4) LIMK-1与MYH9, ACTN4的直接结合检测利用Co-IP检测LIMK-1与MYH9、ACTN4的直接结合作用,结果显示：LIMK-1与MYH9、ACTN4存在直接结合。5) LIMK-1与MYH9、ACTN4的共定位检测利用免疫荧光显微镜检测SW480/HA-LIMK-1细胞中LIMK-1和ACTN4、 MYH9的共定位情况,结果显示LIMK-1与ACTN4、MYH9存在共定位。结论：结直肠癌组织中LIMK-1胞浆与胞核内的表达水平均显著上调,胞浆、胞核内的LIMK-1具有增强结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移能力。LIMK-1在胞浆、胞核内的过表达水平与患者淋巴结转移(N)、远处转移(M)和预后等临床病理参数之间呈正相关关系。