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大豆（Glycine max）是非常重要的粮食和油料作物。大豆孢囊线虫病（Heterodera glycines,SCN）是限制其产量的重要土传病害之一,因其生理小种复杂和孢囊在土壤中存活时间长等特点,导致线虫防治困难。化学农药虽然能有效的防止SCN,但高毒高残留使其停止使用或者限制使用;抗病品种抗源单一并且抗性极易被打破;生物防治田间不稳定等等,这些局限性增加了防治难度。因此,目前最热门的研究就是加强对线虫与寄主互作机制方面的认识来开发更为安全、广谱和高效的杀线虫剂。大豆孢囊线虫二龄幼虫早期识别寄主的过程十分关键,与能否成功寄生相关,涉及大豆孢囊线虫二龄幼虫的化感识别、运动、代谢和免疫调节等生物学过程。如果能在线虫识别寄主早期阶段对其干扰或者打断,就能有效阻止线虫侵染进而达到防治目的。已有的研究表明植物寄生线虫与植物早期的互作受到植物及其根际微生物释放的化学信号及线虫本身因素（例如信息素和神经肽等）等影响,但对大豆孢囊线虫与寄主植物早期互作的关系知之甚少,对参与识别寄主信号的线虫致病基因的认识更是缺乏;此外,在模式生物秀丽隐杆线虫及其它线虫中所报道参与线虫取食、运动、代谢等多种生物学过程的酰胺多肽（FMRF-amide Like Peptides,flp）类基因是目前研究的热点,这类神经肽基因在线虫中具有保守性,并常被作为开发新型人类药物的靶标基因之一,但对大豆孢囊线虫中flp基因的研究基本上是空白。基于此,本实验通过RNA-Seq在转录组范围内开展了线虫早期识别寄主的预寄生基因的鉴定和验证,然后利用RNA-Seq的转录组序列筛选鉴定了大豆孢囊线虫中的flp基因,对其进行了功能初探。获得结果如下:1、经过转录组数据分析,共组装得到56,947个Unigene,经NR等数据库注释的Unigene为29,031个;通过与对照组比较,线虫识别寄主植物3 h和24 h后,鉴定到差异表达基因共359个,其中上调表达基因223个,下调表达136个。最终筛选出置信度最高的14个差异表达基因,分别编码毒素过敏原样蛋白、细胞壁降解酶、效应蛋白、维生素B1合成酶、热激蛋白70、噻唑合酶、S型半胱氨酸组织蛋白酶、顺式还原铜双加氧酶、金属蛋白酶、核苷二磷酸激酶等。其中对3个差异表达基因核苷二磷酸激酶（Ndk）、金属蛋白酶（Ftsh）和噻唑合酶（Thi G）的测序结果进行q RT-PCR验证,二者结果基本一致,说明这些基因可能参与二龄幼虫识别寄主及早期寄生等生物学过程。后续工作将通过PCR技术克隆这些潜在的候选基因,利用基因沉默技术并结合线虫行为学等试验方法验证其生物学功能,从而为新型防线策略的开发提供理论支持及分子靶标。2、根据转录组文库结果,共筛选到13种可能的FLPs编码基因,分别为Hg-flp-1、Hg-flp-3、Hg-flp-5、Hg-flp-6、Hg-flp-7、Hg-flp-11、Hg-flp-12、Hg-flp-13、Hg-flp-14、Hg-flp-16、Hg-flp-18、Hg-flp-22及Hg-flp-27。筛选到的13种flp基因通过测定,表达量在对照组与处理组间没有显著差异,同时,经序列同源比对分析发现flp在线虫种间具有较高的保守性。3、其中Hg-FLP-1、Hg-FLP-6、Hg-FLP-7、Hg-FLP-11、Hg-FLP-12、Hg-FLP-14、Hg-FLP-16、Hg-FLP-18及Hg-FLP-27都分别与植物线虫中对应FLPs序列同源性最高。Hg-FLP前体肽序列中含有KR/K/R三种剪切位点,暗示FLP前体需要经过翻译后修饰才具有生物学活性。q RT-PCR分析了Hg-flp发育表达模式,发现二龄幼虫期Hg-flp基因表达水平最高平,推测这些FLPs与线虫的识别、寄生等过程密切相关。4、实验选取了Hg-flp-1和Hg-flp-11基因进行了功能验证。原位杂交结果显示,Hg-flp-1和Hg-flp-11主要在二龄幼虫腹神经索（ventral ganglion）区域的神经元中表达。体外喂食ds RNA抑制Hg-flp-1表达后,二龄幼虫的侵染率和雌虫数均显著降低;然而对Hg-flp-11的体外RNAi沉默并不影响J2的侵染和后期繁殖,可能与FLPs家族成员功能冗余有关。构建植物RNAi表达载体并转化大豆发根,寄主体内干扰Hg-flp-1后,雌虫数反而比对照显著上升,表明在SCN侵染后降低flp-1表达可能有助于线虫建立取食位点和后期发育。然而体内与体外干扰试验结果相反,不能排除可能是与两种RNAi沉默技术的作用途径有关。体内干扰Hg-flp-11表达后,线虫的繁殖率与对照组无显著差异。5、通过外源添加人工合成FLPs进一步对Hg-FLP-1和Hg-FLP-11的生理功能进行验证。结果显示,5种FLP-1（a\b\c\d\e）及2种FLP-11（a\b）处理均能显著增加J2的移动能力,并且具有浓度依赖效应,这可能与线虫通过体表吸收外源肽的效率有关。FLP-1e（100μM、10μM、1μM）、10μM FLP-11a和100μM FLP-11b处理后雌虫数显著增加,表明FLP-1e、FLP-11a和FLP-11b刺激线虫活跃有助于建立取食位点。然而FLP-1b\c\d\e、FLP-11a/b对侵染率未产生任何显著影响,且根尖周围的二龄幼虫数量减少,推测是由于外源肽处理后线虫过度兴奋所致。综上所述,通过转录组获得与大豆孢囊线虫早期识别寄主相关的基因丰富了我们对线虫与寄主早期互作的认识,这些候选基因为下一步解析其生物学功能奠定了实验基础。13种Hg-flp基因的克隆和Hg-flp-1、Hg-flp-11功能的解析填补了大豆孢囊线虫中FLPs功能研究的空白。初步明确了Hg-flp-1基因不仅参与了线虫的识别,并且线虫后期发育过程中也发挥重要作用;此外,获得Hg-flp基因信息对于开发基于神经肽类的杀线虫剂奠定了坚实的理论基础。