天麻是一种名贵的中药材,属于一种真菌营养型兰科植物,能镇静催眠、抗惊厥眩晕、镇痛、改善记忆、治疗老年痴呆,还能够提高免疫力。天麻主要药用活性成分为天麻素和对羟基苯甲醇,药用天麻两者总含量不能低于0.25%。天麻中活性成分的合成与细胞色素P450相关,而细胞色素P450还原酶（CPR）是细胞色素P450酶系（CYPs）中重要的组成成分,为CYPs提供电子。蜜环菌是天麻生长过程中最重要的大型共生真菌,侵入到天麻体内的蜜环菌将被天麻消化转化为营养物质供给自己生长,蜜环菌的生长影响到天麻产量和品质。蜜环菌主要靠降解菌材中的木质纤维素为葡萄糖等小分子有机物供蜜环菌生长需要。蜜环菌利用菌材能力与蜜环菌分泌漆酶活性有关。目前,天麻是药食同源植物,市场需求量大,主要靠人工栽培天麻满足市场需求。然而,人工栽培天麻功能活性成分含量和利用菌材效率比较低。因此,本研究利用生物工程技术,首先建立蜜环菌转基因技术,然后通过蜜环菌天麻转录组测序,基于转录组数据,筛选天麻细胞色素P450还原酶基因（GeCPR）和蜜环菌漆酶基因（Lac）,找出他们CDS序列,通过RACE-PCR技术扩增出这些基因全长序列,构建Lac基因真核过表达载体,转入蜜环菌以期提高漆酶活性和提高蜜环菌对菌材利用效率,促进蜜环菌的生长;构建GeCPR基因真核过表达载体,转入蜜环菌以期使蜜环菌能够转化前体物质甲苯为4-羟基苯甲醇,提高蜜环菌4-羟基苯甲醇含量,再通过接种天麻提高天麻4-羟基苯甲醇含量和天麻素含量,为天麻生产提供新的栽培技术和方法。获得如下主要研究结果:利用红色光荧光蛋白对蜜环菌转基因方法进行研究。从plot1载体上扩增出红色荧光蛋白基因,并成功构建真核表达载体pH2GW-35S-mRFP1。通过农杆菌介导法转化蜜环菌,在转基因蜜环菌中观察到红色荧光,说明农杆菌介导法可用于蜜环菌转基因方法。同时对农杆菌介导法的影响因素进行了优化。基于蜜环菌和天麻转录组分析数据,筛选出蜜环菌降解菌材的漆酶基因,找出CDS序列,通过RACE-PCR技术克隆获得该基因全长1617 bp,能编码538个氨基酸残基,组成Lac蛋白的氨基酸中丙氨酸含量最高。对该蛋白进行生物信息学分析,预测该蛋白质的分子量为59千道尔顿,理论PI值为4.28,整体呈亲水性,有42个氨基酸位点呈现不同程度的磷酸化。对Lac蛋白进行三维建模,发现无规卷曲为其主要结构。本实验成功构建漆酶基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,获得重组蛋白。对重组蛋白进行酶学特性分析发现,该酶的最适温度为40℃,最适的pH值为4,金属离子Fe²⁺对该酶的活性具有抑制作用,Mg²⁺,Cu²⁺能够促进漆酶活性,Ca²⁺,K⁺,Na⁺,Zn²⁺四种离子对漆酶的活性影响较小。基于天麻蜜环菌转录组分析数据,筛选出细胞色素P450还原酶（GeCPR）相关基因。RACE-PCR技术克隆获得该基因全长2094bp,能编码697个氨基酸残基,这些氨基酸残基中亮氨酸含量最高。对该蛋白进行生物信息学分析,预测该蛋白质分子量为77千道尔顿,理论PI值为5.28,整体呈亲水性,有67个磷酸化位点,对GeCPR蛋白进行三维建模,发现α螺旋为其主要结构。本实验成功构建GeCPR基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,纯化获得重组蛋白。酶学特性分析表明GeCPR酶的最适温度为35℃;最适pH值为8;Cu²⁺,Fe²⁺和Mg²⁺对酶活性有抑制作用,Zn2+对GeCPR活性具有较强的抑制作用,Ca2+,K⁺和Na⁺对酶活性基本无影响。利用Gateway技术成功构建了GeCPR基因的真核表达载体pH2GW-35S-GeCPR,通过农杆菌pMP90转染蜜环菌,获到具有阳性克隆的转GeCPR基因蜜环菌工程菌株。该菌株能够成功催化对甲酚转化为对羟基苯甲醇。