蛋白质组学是研究生物机体内在变化,以及蛋白质和相关基因功能的重要手段。我们通过这项技术可以了解病原体感染的宿主体内免疫系统调控,代谢通路调节等一些系列机体的应激变化。当宿主被外界病原微生物感染时,其体液免疫和细胞免疫会发生相应的免疫应答反应,主要原因是参与免疫调控的相关蛋白表达量发生了变化。因此,宿主感染病原体后,研究免疫相关蛋白的调控对于探究微生物致病机制和宿主免疫调控机理非常重要。在这些相关蛋白中有些会涉及到宿主作为生物反应器对大型哺乳类动物的过敏性炎症反应中,而有些则是宿主能够有效预防病原微生物的有利手段,但是极个别的蛋白也能够参与到外界病原对宿主的感染过程中,从而提高病原的危害性。本实验应用三种不同的蛋白质组学技术,对家蚕在BmNPV感染后免疫相关蛋白和基因的调控进行了深入研究。1.双向电泳技术优化体系建立本次实验对采用四种不同的纯化以及蛋白提取方法,3种不同聚焦时间,两种考马斯亮蓝染色法和胶条PH值以及平衡时间对家蚕蚕蛹双向电泳结果的影响。实验结果表明,用于TCA-丙酮进行研磨后过夜沉降提取的蛋白效率最高,获得的蛋白点最多,8000v,80000vh时蛋白纵横条带较少,且蛋白点明显。采用ph4-7胶条以及平衡时间在15分钟时有利于消除纵条纹,得到更好的优化结果。而染色液方法则各有优缺点。这次探究为家蚕蚕蛹蛋白质组学的研究奠定基础。2.家蚕杆状病毒对家蚕四种过敏原蛋白表达的影响蚕蛹的一些蛋白能够引起人和动物严重的过敏反应。这使蚕蛹的药用价值在临床应用中受到极大的制约。有趣的是,一些杆状病毒载体已被证明可以调控宿主的基因及蛋白的表达,但这在家蚕中尚未得到证实。实验分析了BmNPV空载体感染对蚕蛹蛋白表达的影响。使用蛋白质组学方法,鉴定了硫醇过氧化物酶(Jafrac1),27-kDa糖蛋白(p27k),精氨酸激酶和副肌球蛋白四种重要过敏原和另外32种差异表达的蛋白质。在BmNPV感染后观察到4种已知过敏原的mRNA表达下调;随后使用原核表达制备了四种过敏原的重组蛋白和多克隆抗体。通过荧光定量和蛋白质印迹验证了四种过敏原蛋白的mRNA和蛋白的变化。该研究表明,通过用空BmNPV载体感染可以降低蚕蛹中已知四种过敏原蛋白的表达。这不但提高了蚕蛹表达的外源蛋白作为口服药物的给药安全性,而且四种重组过敏原蛋白可应用于因蚕蛹过敏的临床诊断。3.家蚕杆状病毒对家蚕丝氨酸家族和抗菌肽家族表达的影响在家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染后,使用蛋白质组学筛选家蚕蛋白,鉴定6种抗菌肽和12种serpins。在不同时间检查这18种蛋白质的mRNA表达水平。结果表明,attacin表达水平最高,而serpin-5和cecropin-D表现出负调控相关性。这些结果为更深入地了解家蚕免疫调节提供了重要的一步。4.家蚕杆状病毒对家蚕免疫相关蛋白表达的影响用iTRAQ技术研究在感染BmNPV前后家蚕的免疫相关蛋白表达变化。使用同量异位标签对感染前后的蛋白质组进行相对和绝对定量分析以及LC-MS分析。共鉴定出372种差异表达的蛋白质,其中179种被上调,193种被下调。通过蛋白质印迹验证几种蛋白质的表达变化。其中,着重研究了11种差异表达的蛋白质参与免疫系统所扮演的角色。例如,下调的丝氨酸蛋白酶和天蚕素能够促进Toll和Imd信号传导,而自噬相关蛋白3(其被上调)保护细胞免受氧化损伤。