原发性肝细胞癌(以下简称肝癌)是人类常见的恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤的第5位，全球每年有50万以上新发病例，其恶性程度高，预后差，是肿瘤相关死亡的第3大原因。在我国，肝癌患者约占全世界肝癌总数的一半，每年约有11万人死于肝癌，死亡率居恶性肿瘤的第2位。侵袭和转移是肝癌的显著特征，也是其预后差的主要原因，因此抑制肝癌的侵袭和转移是肝癌治疗的重要策略。进一步阐明肝癌侵袭与转移的分子机制有助于发现肝癌治疗的新靶点，也有助于改善肝癌的预后。　　 Hedgehog(HH)信号通路在胚胎发育期间调控着多种细胞的分化和生长，对维持成熟器官内环境稳定及维持某些成熟器官中干细胞的功能也起着非常重要的作用。大量研究已表明异常激活的HH信号通路与基底细胞癌、髓母细胞瘤、小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌等多种人类肿瘤的发生发展密切相关。近年，研究也发现异常激活的Sonic Hedgehog(SHH)信号通路在肝癌的发生中起重要作用。而且，SHH信号通路在多种类型细胞运动与迁移的控制及血管形成中发挥重要作用，在卵巢癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌等肿瘤的侵袭与转移中亦起重要作用。但是，SHH信号通路在肝细胞癌的侵袭与转移中的作用目前尚不清楚。　　 基底膜(BM)和细胞外基质(ECM)是抵抗肿瘤细胞浸润与转移的生理屏障。因此，降解BM和ECM是肿瘤侵袭和转移的重要步骤。基质金属蛋白酶(MMP)，尤其是MMP-2与MMP-9是降解ECM与BM的主要酶，与肿瘤的浸润与转移密切相关，在肝癌的侵袭与转移中也起着十分重要的作用。　　 磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)/AKT信号通路可通过调控MMP-9和/或MMP-2参与多种肿瘤的侵袭与转移。而PI3K又是局部粘着斑激酶(FAK)的下游底物，FAK可通过调控PI3K/AKT信号通路进而调节细胞的增殖、粘附等。此外，FAK也可通过调控MMP-2和/或MMP-9的表达参与多种肿瘤的侵袭与转移。　　 PI3K/AKT通路是SHH信号通路所必需，SHH信号可通过激活PI3K/AKT通路促进骨髓源内皮祖细胞、成肌细胞、成纤维细胞等的生长、分化。而在肝癌中SHH信号通路是否是通过调控FAK/AKT信号通路和MMP的表达而影响肿瘤侵袭和转移，目前尚不清楚。　　 本课题首先通过体外实验研究SHH信号通路被激活或抑制时肝癌细胞迁移和侵袭及MMP-2/9表达的变化，并探讨SHH信号通路与FAK/AKT信号通路之间的交叉对话(cross-talk)，然后检测SHH信号通路主要成分与FAK/AKT信号通路关键成分、MMP-2/9在肝癌组织中的表达及相关性，力图证实SHH信号通路在侵袭与转移中的作用及其机制，从而进一步阐明肝癌侵袭与转移的分子机制，可能为抗肝癌侵袭与转移提供新的治疗靶点，为肝癌预后判断与改善提供新思路。　　 第一部分 Sonic Hedgehog信号通路在肝细胞癌迁移和侵袭中的作用　　 目的：　　 探讨Sonic Hedgehog(SHH)信号通路在肝癌细胞迁移和侵袭中的作用。　　 方法：　　 肝癌SK-Hep1、SMMC-7721细胞用于本研究。应用real-time PCR检测肝癌SK-Hep1、SMMC-7721细胞中SHH、PTCH1、Smo、Gli-1 mRNA表达情况；应用real-time PCR和Western-blot检测细胞转染Gli-1 siRNA后mRNA和蛋白的表达情况；应用细胞粘附实验检测胞粘附能力；应用划痕实验分析细胞运动能力；应用Transwell迁移和侵袭实验分别分析细胞迁移和侵袭能力；应用MTT法检测细胞活力。　　 结果：　　 外源性重组SHH-N能呈剂量依赖性增加肝癌细胞粘附、运动、迁移和侵袭能力；SHH中和抗体或cyclopamine能呈剂量依赖性抑制肝癌细胞的粘附、运动、迁移和侵袭能力；Gli-1 siRNA能明显下调肝癌细胞中Gli-1 mRNA和蛋白表达；Gli-1 siRNA也能明显抑制肝癌细胞的粘附、运动、迁移和侵袭能力；但重组SHH-N、SHH中和抗体、cyclopamine及Gli-1 siRNA均不影响肝癌细胞生长。　　 结论：　　 SHH信号通路参与肝癌细胞的迁移和侵袭，且这种作用不依赖于其细胞毒性作用，提示SHH信号通路可能是肝癌的治疗靶点。　　 第二部分 Sonic Hedgehog信号通路促进肝细胞癌迁移侵袭的机制研究　　 目的：　　 研究Sonic Hedgehog(SHH)信号通路促进肝癌细胞迁移和侵袭的机制。　　 方法：　　 应用real-time PCR检测mRNA表达；应用MMP明胶酶活性实验分析MMP-2和MMP-9活性；利用Western-blot分析蛋白表达；通过FAK siRNA下调肝癌细胞FAK表达；应用Transwell迁移和侵袭实验分别分析细胞迁移和侵袭能力。　　 结果：　　 外源性重组SHH-N能呈剂量依赖性增加肝癌细胞MMP-2和MMP-9mRNA、蛋白表达及活性；而SHH中和抗体、cyclopamine则呈剂量依赖性减少肝癌细胞MMP-2和MMP-9 mRNA、蛋白表达及活性。MMP抑制剂GM6001、MMP-2抗体、MMP-9抗体能抑制重组SHH-N所诱导的肝癌细胞迁移和侵袭。　　 重组SHH-N、SHH中和抗体、cyclopamine均不影响肝癌细胞中TIMP-1和TIMP-2的表达。　　 外源性重组SHH-N能呈剂量依赖性增加肝癌细胞中磷酸化AKT(Ser473)(p-AKT)蛋白表达；而SHH中和抗体、cyclopamine能呈剂量依赖性减少肝癌细胞中p-AKT蛋白表达。但重组SHH-N、SHH中和抗体、cyclopamine均不影响肝癌细胞AKT蛋白表达。重组SHH-N诱导的肝癌细胞迁移和侵袭、MMP-2和MMP-9的表达及活性均能被PI3K特异性抑制剂LY294002明显抑制。　　 外源性重组SHH-N呈剂量依赖性增加肝癌细胞中磷酸化FAK(Tyr397)(p-FAK)蛋白表达；而SHH中和抗体、cyclopamine则呈剂量依赖性减少肝癌细胞中磷酸化p-FAK蛋白表达。但重组SHH-N、SHH中和抗体、cyclopamine均不影响肝癌细胞FAK蛋白表达。下调肝癌细胞中的FAK表达能明显抑制重组SHH-N诱导的肝癌细胞迁移和侵袭、MMP-2和MMP-9的表达与活性及p-AKT表达。　　 结论：　　 SHH信号通路通过上调FAK/AKT信号通路介导的MMP-2和MMP-9表达和活性促进肝癌细胞迁移和侵袭。　　 第三部分 Sonic Hedgehog信号通路主要成分在肝细胞癌组织中的表达及其与FAK/AKT信号通路、MMP-2和MMP-9的相关性　　 目的：　　 研究Sonic Hedgehog(SHH)信号通路主要成分、FAK/AKT信号通路关键成分与MMP-2/9在肝细胞癌组织中的表达及其相关性。　　 方法：　　 收集2004年7月至2007年3月期间中山大学附属第一医院手术切除的200例经病理确诊的肝细胞癌及相应癌旁组织标本，构建组织芯片，应用免疫组化染色检测SHH、PTCH1、Smo、Gli-1、FAK、磷酸化FAK(Tyr397)(p-FAK)、磷酸化AKT(Ser473)(p-AKT)、MMP-2和MMP-9蛋白的表达；应用reai-time PCR分析其中36例肝细胞癌组织与癌旁组织中的SHH、PTCH1、Smo、Gli-1、FAK、MMP-2和MMP-9 mRNA的表达。分析各指标与肝癌临床病理参数的相关性。采用Spearman's相关检验分析肝细胞癌组织中各蛋白间的相关性。　　 结果：　　 肝癌组织中SHH、PTCH1、Smo和Gli-1蛋白和mRNA表达水平均明显高于相应的癌旁组织；SHH、Smo、Gli-1过表达与肝癌TNM分期、血管侵犯及肝内转移密切相关；PTCH1与肝癌分化程度有关，而与肿瘤浸润和转移无关；FAKmRNA和蛋白、p-FAK蛋白在肝癌中表达明显增高，且与肝癌包膜侵犯、较高的TNM分期、血管侵犯及肝内转移密切相关；肝癌组织中p-AKT过表达与肝癌分化程度、肝内转移、血管侵犯、TNM分期及较高的Ki-67增殖指数密切相关；MMP-2和MMP-9在肝癌中的表达水平与肝硬化、包膜侵犯、肝内转移、血管侵犯和较高的TNM分期密切相关；肝癌组织中SHH和Gli-1蛋白表达均与p-FAK、p-AKT、MMP-2和MMP-9成正相关。　　 结论：　　 SHH信号通路在肝癌组织中是激活的，并参与肿瘤浸润和转移；SHH信号通路与FAK/AKT通路及MMP-2/9成正相关。