论文部分内容阅读
α-环糊精糖基转移酶（α-cyclodextringlycosyltransferase，简称CGT酶）属于糖苷水解酶家族13中的一员，通过环化反应催化淀粉生成环糊精，环糊精是由n(n≥6)个葡萄糖残基组成的内疏水外亲水的中空圆筒状结构。由于其特殊的空间结构，可以与多种化合物形成包合复合体，因此，在食品、化妆品、医药、纺织、环境保护等方面具有广泛的应用。α-CGT酶已经越来越引起人们的重视。
α-CGT酶催化淀粉生成环糊精，多以α-、β-、γ-CD三种混合物的形式存在。该酶的产物专一性较差，对α-CD的产率和后提取工艺皆造成不利影响。另外，α-CGT酶基因在异源表达过程中往往形成包涵体。针对上述两个问题，本论文通过将来源于Bacillussp.602-1的α-CGT酶基因构建工程菌，并探索促进重组α-CGT酶胞外酶活释放的条件、优化自诱导表达条件等途径，实现酶蛋白的高效活性表达;同时，利用Error-PCR技术对α-CGT酶基因进行分子改造，进一步提高α-CGT转化生产α-CD的专一性。主要研究结果如下:
1、将来源于野生菌Bacillussp.602-1的α-CGT酶基因分别插入到表达载体pET22(b+)、PQE30中，构建重组质粒pET22(b+)/cgt、PQE30/cgt，分别转化到表达菌株EcoliBL21(DE3)、E.coliM15中，得到工程菌E.coliBL21(DE3)(pET22(b+)/cgt)、E.coliM15(PQE30/cgt)。
2、将E.coliBL21(DE3)(pET22(b+)/cgt)菌株发酵培养，确定了重组酶胞外酶活释放的两种最佳条件:一是发酵培养基为TB，IPTG浓度为0.01mmol/L，甘氨酸浓度为150mmol/L，甘露醇浓度为0.25mol/L，此时，酶外活力为11702U/mL，与不加IPTG(1963U/mL)相比，胞外酶活提高了5倍;二是优化的自诱导表达培养条件:葡萄糖浓度为1.2g/L，乳糖浓度为1g/L，胞外酶活力为10092U/mL。
3、对E.coliM15(PQE30/cgt)菌株发酵培养，确定重组酶胞内表达的最佳条件:在发酵培养基为TB，IPTG浓度为0.01mmol/L时，胞内酶活为5209U/mL;在发酵培养24h后，向培养基中添加甘氨酸和甘露醇，发现有部分α-CGT酶释放到胞外;在自诱导培养基中葡萄糖和乳糖的浓度分别为1.2g/L、3g/L，胞内酶活为8635U/mL。
4、将重组表达载体pET22（b+）/cgt转化到表达宿主菌E.coliOrigamiB(DE3)中，经SDS-PAGE电泳发现，在该宿主菌内生成的包涵体较少，但是胞外酶活表达量低于E.coliBL21(DE3)(pET22(b+)/cgt)，因此，后续实验仍将E.coliBL21(DE3)作为表达宿主菌。
5、利用HPLC对重组α-CGT酶催化可溶性淀粉的产物情况进行分析发现，重组α-CGT酶催化生成3种产物的比例分别是74％，21.7％，4.3％。相对于野生酶催化淀粉转化后的α∶β峰面积比为2.4，重组酶催化生成的α-CD所占的比例较高(α∶β峰面积比为3.4);
6、重组α-CGT酶催化生淀粉的产物情况进行分析发现，用异淀粉酶液化质量分数为6％(w/v)玉米淀粉后，按400U/g酶活单位加入α-CGT酶反应24h后，生成的α∶β之间的比值为2.3，因此，为该酶在淀粉工业上的应用提供一定支持。
7、利用易错PCR技术构建突变文库，库容量约为70，000株。经过平板初筛，挑取153株菌株分别进行液体培养诱导表达，酶促催化产物经HPLC分析，成功筛选到一株产物专一性显著提高的菌株，编号为95号，产物中α∶β为7.3（而重组α-CGT酶转化生成α∶β的比值约为3.3）。测序发现，有两个氨基酸发生突变，分别为Y167H、A536V。
8、对95号H167Y位点回复突变后酶蛋白专一性分析发现，α∶β降低变为2.8;将V536A回复突变后酶蛋白专一性分析发现，α∶β为6.7;由此可见第167位点为组氨酸时对高α-CD的生成有重要作用。而第536位缬氨酸对高α-CD的生成无显著影响。第167位残基位于-6区域内，该位点对产物专一性可能有一定的影响。
9、第167位点进行饱和突变分析，从74株单菌落中筛出15种氨基酸，有非极性、极性中性、酸性及碱性氨基酸。通过HPLC分析发现，目前组氨酸为最优氨基酸。
10、将突变α-CGT酶发酵培养后，利用Ni2+-NTA一步纯化，比活力提高至54230.7U/mg，纯化倍数为7.3倍。将纯化后突变α-CGT酶学性质分析得出:最适温度为50℃，最适pH为7.4，酶活力为11705U/mL，Cu2+、Fe2+、Zn2+离子严重抑制了酶的活力，K+、Na+离子对酶活力的影响不大，另外Ba2+、Ca2+并未像文献报道的一样，对突变α-CGT酶有一定的激活效应。