狂犬病是由狂犬病病毒引起的人兽共患疾病，几乎遍及全世界各个国家。狂犬病一旦发病尚无有效治疗措施，死亡率几乎为100%[1]。由于狂犬病的传染源广泛存在，全球每年死于狂犬病的人数超过5.5万人，并且每年至少有1650万人需要接受狂犬病病毒暴露后治疗，疾病控制难度很大。我国是受狂犬病危害最为严重的国家之一，仅次于印度，居全球第二位。据保守估计，我国每年超过3000人死于狂犬病，并且近几年发病率呈现逐年上升的趋势。因此研制有效的狂犬病防治药物具有重要意义[2]。世界卫生组织（WHO）建议，对狂犬病的III级暴露及免疫力低下患者的II级暴露治疗，必须立即接种狂犬病疫苗和抗狂犬病病毒免疫球蛋白（RIG）。目前，临床上使用的RIG包括马抗狂犬病病毒免疫球蛋白（ERIG）和人抗狂犬病病毒免疫球蛋白（HRIG）两类。ERIG易引起过敏反应和血清病；HRIG成本高且产量少，存在潜在病毒污染的危险；血源产品质量难以控制，临床使用存在安全隐患，难以满足临床用药需求，其治疗效果也有待于提高[3,4]。因此，研发全人源基因工程抗体替代传统的血源性免疫球蛋白已迫在眉睫。本研究应用噬菌体抗体库技术，构建抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库，从中富集、筛选具有中和活性的全人源抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体，为研制可用于人狂犬病病毒暴露后的紧急预防药物奠定基础。研究方法1.构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库取130位经狂犬病疫苗免疫志愿者的外周血淋巴细胞，提取总RNA，逆转录制备cDNA；用人源特异性抗体引物扩增VH、VL基因，再经过重叠PCR制备scFv基因片断；将scFv片断与pComb3XSS同时经SfiI酶切、纯化并连接后电转化入宿主菌E.coli.XL1-Blue，加入辅助噬菌体VCSM13过夜培养后，上清经PEG8000/NaCl沉淀，构建抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库。2. E.coli.TOP10F′原核表达系统表达并纯化狂犬病病毒G蛋白（RVG）以逆转录制备的cDNA为模板，扩增RVG基因，PCR产物胶回收纯化，经酶切与重组质粒pColdⅡ连接，连接产物测序正确后进一步转化E.coli.TOP10F′感受态细胞，IPTG诱导表达，Western Blot鉴定，His-Trap HP镍亲和柱纯化狂犬病病毒G蛋白，SDS-PAGE电泳及质谱鉴定。3.抗狂犬病病毒G蛋白特异性scFv抗体的筛选、表达及中和活性鉴定以纯化的狂犬病病毒G蛋白包被ELISA板，将构建的抗体库进行“吸附-洗脱-富集”，从筛选得到的细菌集落中随机挑选单克隆，phage-ELISA鉴定。阳性克隆经序列分析后，进行表达、纯化和结合活性的初步鉴定；ELISA、荧光抗体中和试验等对表达产物进行生物学活性鉴定。研究结果1.构建全人源抗狂犬病病毒噬菌体抗体库：采用噬菌体展示技术，经over-lap PCR扩增得到scFv基因片段约750bp，电转化导入E.coli.XL1-Blue中，构建了库容为5.0107的全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库。2.狂犬病病毒G蛋白的表达：根据GenBank收录的狂犬病病毒G蛋白基因序列，设计特异性引物，以cDNA为模板扩增出RVG基因片段，扩增片段大小为1500bp，与预期相符；将扩增产物纯化与载体质粒pColdⅡ酶切后连接测序，测序正确后，转化E.coli.TOP10F′感受态细胞，诱导表达，Western Blot鉴定表明为目的蛋白，SDS-PAGE电泳显示纯化后蛋白分子量大小67KD。质谱鉴定结果证明所表达的蛋白为狂犬病病毒G蛋白（rabies virus strain CTN glycoproteinGI:11528007）。3.抗狂犬病病毒G蛋白特异性scFv抗体的筛选及表达：以纯化的狂犬病病毒G蛋白为抗原进行了五轮富集筛选，从全人源scFv噬菌体抗体库中筛选抗狂犬病病毒抗体，每一轮筛选后噬菌体抗体收获率均有增加，第五轮筛选的噬菌体抗体收获率较第一轮提高了20倍；共获得4株核酸序列不同的scFv抗体，分别为scFv28、scFv70、scFv44、scFv42，初步检测后进行表达，纯化。4.抗狂犬病病毒G蛋白特异性scFv抗体生物学活性鉴定：通过ELISA等方法对筛选出的抗体进行初步生物学活性分析，结果表明，4株scFv抗体均可与狂犬病病毒及G蛋白特异性结合；抗体中和试验结果证实，scFv42具有中和活性。研究结论1.成功构建了全人源抗狂犬病病毒噬菌体抗体库，库容为5.0107，为制备抗狂犬病病毒抗体奠定了基础。2.通过原核表达体系表达并纯化了狂犬病病毒G蛋白，为筛选全人源抗狂犬病病毒G蛋白抗体提供了抗原。3.筛选获得4株抗狂犬病病毒抗体，证明其中一株抗体scFv42具有中和活性，具有替代目前血源性免疫球蛋白用于狂犬病病毒暴露后治疗的潜能。