水稻是全球最主要的粮食作物之一,世界上一半以上的人口以稻米为主食,在我国比例更是高达60%以上·目前,在我国人口数量不断增加,而耕地面积不断减少的形势下,通过大幅度提高单位土地面积的粮食产量是保障我国粮食安全的唯一途径。二十世纪七十年代中期杂交水稻的成功培育,是世界农业发展史上的一次重大突破,被誉为继水稻矮化育种之后的“第二次绿色革命”,创造了巨大的经济效益和社会效益。然而,统计数据表明近些年水稻单产的提高潜力已经十分有限。其主要原因一方面是配制杂交组合的亲本遗传资源缺乏,亲本间遗传差异小,导致杂种优势不强;另一方面是种间、亚种间杂种优势强大,但普遍存在生殖隔离等问题,严重限制了杂种优势的直接利用。因此,探索雄性不育,种间生殖隔离机理对进一步利用杂种优势具有重要的理论价值和实践意义。水稻杂种优势的利用最早是从发现一株典型花粉败育野生稻获得突破的。典败型花粉的产生是由于花粉不能正常进行减数分裂导致的,因此,了解水稻减数分裂分子机理能更好的为杂种优势利用提供理论指导。研究表明,非洲栽培稻经过长时间的人为选择进化,聚集了很多亚洲栽培稻缺乏的优良特性,如抗虫、抗病、抗逆以及旺盛的生长优势。因此,为了丰富水稻的遗传资源,提高水稻产量,打破育种瓶颈,将非洲栽培稻优异基因导入到亚洲栽培稻是远缘杂种优势利用的首选。然而,亚洲栽培稻和非洲栽培稻的杂交F1存在严重的生殖隔离,如何深入了解并克服杂种不育是有效利用栽培稻种间杂种优势的前提。本论文分两个方面对水稻雄性不育进行了研究。首先,通过一个水稻雄性不育突变体克隆了水稻OsMSH4基因,对其功能进行了研究;其次,精细定位了种间杂种花粉不育基因S39并对其花粉败育过程进行了详细观察。本研究的主要内容如下:1.从水稻四倍体花药组织培养后代中,我们发现一株三体植株6537。该植株与正常植株相比叶色更深,叶片变窄且伴有卷曲,染色体压片观察发现其多了一条染色体,证明6537是典型的三体植株。从6537的自交后代中,分离出大约有3/4的完全不育株,暂命名为Osmsh4突变体。用I2-KI溶液对突变体的花粉进行染色,观察显示其不能被染色。扫描电镜观察显示突变体的花粉粒大小不均一,且形状不规则;透射电镜观察发现其内部没有淀粉粒的积累,花粉粒壁的发育也不完全,从而导致Osmsh4突变体的花粉是完全败育的。利用激光共聚焦扫描电镜对Osmsh4突变体的胚囊发育进行观察发现其不能进行正常的减数分裂形成四分体,以致丧失功能大孢子的分化,没有七细胞八核正常胚囊形成,最终导致Osmsh4突变体的胚囊也败育。2.花粉母细胞染色体减数分裂观察发现在粗线期及其之前,Osmsh4突变体和野生型在染色体行为上没有明显的差别,然而在双线期,Osmsh4突变体花粉母细胞中开始有单价体的出现,到了终变期这种单价体数目逐渐增多,且尤为明显。从后期Ⅰ到末期Ⅱ,由于单价体的随机分离,导致移动到两极的染色体数不均等。这种不均等势必会导致随后形成的小孢子体内染色体组的紊乱,产生三分体或者微核。与野生型12条二价体相比,Osmsh4突变体平均只有3.95条。由于交叉结是稳定二价体的保障,因此突变体中二价体数目的减少很可能是交叉结数目的减少引起的。统计发现野生型平均有20.58个交叉结(n = 81),而Osmsh4突变体只有4.51个(n= 152)。而且突变体中剩余交叉的分布是随机的,与泊松分布相吻合;而野生型中的交叉结分布严重偏离泊松分布,说明野生型中的交叉结之间有干涉的存在,而Osmsh4突变体中剩余的交叉结之间则没有干涉存在。3.通过图位克隆我们克隆了 OsMSH4基因。序列比对发现OsMSH4蛋白在其它物种中都是保守的,蛋白分析显示其有一个MUTSd和MUTSac结构域,而Osmsh4突变体的单氨基酸替换正好发生在保守的MUTSd结构域上。我们通过转基因互补实验以及对OsMSH4基因TOS17突变体的调查证实OsMSH4就是目的基因。荧光定量、GUS染色和组织原位杂交分析表明,OsMSH4主要在生殖器官中表达,而且呈现一种动态变化,在减数分裂时期花药的性母细胞中表达最高,随后表达水平逐渐降低直至消失。亚细胞定位显示OsMSH4蛋白主要定位在细胞核中,与其功能相一致。4.前人研究表明MSH4蛋白能和MSH5蛋白一起互作形成异源二聚体结合到Holliday连接体上来稳定单链入侵,通过酵母双杂交和体外pull-down实验我们证明OsMSH4也能和OsMSH5互作,而且突变后的Osmsh4就丧失了与OsMSH5的互作能力;此外,我们还发现OsMSH5能够与OsRPA蛋白复合体中的OsRPA1a, OsRPA2b,OsRPA1c和OsRPA2c四个亚基互作。因为OsRPA复合体是结合到D环和单链DNA上的,说明在减数分裂过程中,OsMSH4/OsMSH5异源二聚体与OsRPA复合体互作来共同调控 Holliday 交叉(Holliday junction)第二链的捕获(second-end capture, SEC )。5.利用以亚洲栽培稻滇粳优1号(DJY)为受体,非洲栽培稻IRGC102295为供体构建的近等基因系(near-isogenic lines, NIL),我们鉴定了种间杂种花粉不育基因S39。细胞学观察发现杂种F1的花粉表现为半不育,属于染败,败育的花粉粒比正常的偏小且形状不规则,淀粉积累少,花粉粒壁发育不完全。进一步的研究发现F1中败育的花粉粒主要为DJY类型,败育时期发生在小孢子中期向晚期转变的过程,由于此过程的滞后导致DJY型的配子不能形成正常的三核花粉,淀粉积累也不完全。6.利用次级分离群体我们将S39定位在第12号染色体79-kb的区间,该区域一共预测了 13个候选基因。对该区间进行测序发现两亲本序列存在较大的差异,其中NIL比亲本DJY多了约82-kb的序列。进一步分析发现S39位于一个400-kb左右的品种间相互倒位区间。荧光定量结果显示定位区间几个基因在花药中高表达,然而单个基因的转基因实验却没有得到互补表型。遗传分析发现S39位点是一个普遍存在于种间和亚种间的杂种不育位点,而广亲和品种Dular,Kasalath在此位点携带有亲和基因。