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四倍体刺槐是我国于1995年从韩国引进的刺槐新品种,和普通刺槐相比,具有速生、枝密、叶大等特点,有一定的抗旱、耐盐、耐瘠薄、抗风沙能力,是生态建设的先锋树种;同时,叶片蛋白含量高,是很有推广价值的优良饲料。为利用基因工程对四倍体刺槐进行进一步的改良,提高其耐盐、抗旱能力,本实验在已建立的四倍体刺槐高频组培再生体系的基础上,进行了农杆菌介导的甜菜碱醛脱氢酶基因转化的研究。主要结果如下: 1.建立了农杆菌介导的四倍体刺槐高效遗传转化体系。在农杆菌介导的基因转化中,首先确定了最适脱菌素类型及浓度为400mg/LCef、愈伤组织的选择压为50mg/LKan、再生植株的选择压为60mg/LKan。然后以GUS+阳性发生率、抗性愈伤组织率、抗性芽分化率和抗性植株率为转化指标研究并优化了影响基因转化的各个因子。结果表明:四倍体刺槐的最佳转化外植体为继代20天的愈伤组织、最佳预培养时间为1~2天、适宜的菌液浓度OD600值为0.3~0.7、侵染时间为6~10分钟、农杆菌活化培养基为1/2MS+1/2YEB、共培养培养基为MS培养基、共培养培养基的最适pH值为4.8~5.8、共培养时间为3~4天、乙酰丁香酮的最适用量为20mg/L、最佳选择方法为延迟10天选择。同时,外植体的创伤方式、侵染方式和培养条件等对转化均有影响。 2.转化植株的PCR检测。转化研究获得了大量Kan抗性植株,以未转化植株基因组DNA为阴性对照,质粒DNA为阳性对照,甜菜碱醛脱氢酶基因的两端序列为特异引物进行PCR检测,在316个被检测的Kan抗性株系中有221个株系呈阳性反应。结果表明BADH基因成功、高效、稳定地整合到四倍体刺槐基因组 3.转基因植株的耐盐性检测。在组培条件下,对转基因植株进行了NaCI抗性试验,结果表明:未转化四倍体刺槐愈伤组织在0.5%NaCI浓度下停止分化,转基因四倍体刺槐愈伤组织在0.8%NaCI浓度下基本正常分化,抗盐性提高0.3%0.4%;未转化四倍体刺槐组培苗在0.3%NaCI浓度下生长受到抑制,在0.4%NaCI浓度下生长受到严重抑制,转基因四倍体刺槐组培苗在O.50/6NaCI浓度下生长基本正常,在0.6%NaCI浓度下生长受到明显抑制,抗盐性提高0.2%0.3%。说明BADH基因在转基因植株中得到了表达,转基因植株比未转化植株具有更强的耐盐性。同时也进一步证明BADH基因转化的成功。