本实验从NTA蛋白的发酵培养出发,以摇床实验数据为基础、以响应面设计优化培养基,结合发酵罐操作参数研究不同的培养条件对NTA发酵表达的影响,用乳糖替代IPTG来诱导生产目标蛋白,实现NTA蛋白的高密度、高表达生产。低速的乳糖诱导有利于乳糖传递至细胞的Lac渗透酶的完全诱导和活化,有利于目标蛋白的表达。确定最佳的接种量为2.5％、培养温度为37℃、诱导时机是OD600为8-10、诱导后的最佳培养时间为6小时、蛋白胨的浓度为15g/L,酵母膏的浓度为14.94g/L,葡萄糖浓度为18.21g/L,发酵结束时OD600为47,NTA的表达率为38.51％,湿菌体产率是75g/L。 发酵生产得到NTA的包涵体进行细胞破碎、洗涤和溶解。确定适合NTA包涵体变性溶解的最佳条件是将每克NTA包涵体在10ml尿素变性缓冲液中进行溶解,其中尿素的浓度为8mol/L,溶液的pH为8.5,添加浓度为30mmol/L的二硫基苏糖醇(DTT)作为还原剂,变性溶解2h。 包涵体的复性过程在重组蛋白的生产中起着非常重要的作用。在常规的凝胶过滤柱复性方法的基础上加以改进,建立一种浓度不断减少的尿素梯度和浓度不断增加的精氨酸梯度的新的双梯度柱复性方法。该复性方法以前没有文献报道。从层析柱顶端到双梯度区域末端,尿素浓度是从8mol/L梯度减少到2mol/L,而精氨酸的浓度从0mol/L梯度增加至0.6mol/L。对双梯度的建立、最初复性蛋白浓度、梯度长度以及洗脱流速等方面也。进行了条件研究,在复性蛋白浓度为20mg/ml时,NTA酶活性回收率为37％。为了获得更高的NTA酶活性收率以及抑制复性过程的蛋白沉淀,将不同的复性方法和复性操作条件加以比较比较。即使在高浓度的复性蛋白条件下,双梯度柱复性方法也比其他的复性方法能更明显的提高NTA复性效果。实验证明该复性方法能应用于其他变性蛋白的复性过程,其复性率均高于文献报道。 NTA变性蛋白经双梯度柱复性后,用阴离子进行初步纯化,脱盐后用亲和层析进一步的纯化得电泳纯的NTA蛋白。亲和层析过程中,用L-精氨酸代替NaCl洗脱,总蛋白回收率从88％增至95％。层析纯化过程中,总蛋白质量回收率为88.4％,NTA蛋白回收率为81.77％经检测,纯化后的NTA蛋白电泳显示单一条带,比活力是109880U/ml,HPLC测其纯度为95.67％,该蛋白的相对分子量是38990,等点电为4.60。以溶菌酶为模型蛋白,对L-精氨酸辅助蛋白质复性的过程和机理进行研究。通过测定复性后酶活性和计算其蛋白复性,确定L-精氨酸助溶菌酶复性的最佳复性条件是复性蛋白浓度为200～300 ug/mL、添加L-精氨酸最佳浓度为0.8 mol/L。首次利用蛋白质的复性和聚集反应竞争三态动力学模型描述L-精氨酸助溶菌酶复性动力学。在复性蛋白浓度100～500 ug/mL、L-精氨酸浓度0～1.0 mol/L范围内,分析了复性蛋白浓度及L-精氨酸浓度对复性动力学常数的影响。结果表明:L-精氨酸助溶菌酶复性符合3级聚集反应动力学,L-精氨酸的主要作用是抑制蛋白聚集体的生成速率,从而达到提高复性收率的效果。实验发现:L-精氨酸主要是其侧链的胍基与蛋白分子中芳香族氨基酸Trp、Tyr、Phe有弱的作用力,从而抑制蛋白分子内的疏水性氨基酸之间的疏水作用力。其作用方式是蛋白质分子中的芳香族氨基酸的苯环与L-精氨酸的胍基通过类似于π电子-离子的方式发生作用。