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microRNAs(miRNAs)是一类存在于真核生物的非编码微小RNA,能对基因进行最广泛的调节,参与动物体内的大部分生命活动。miRNAs在骨骼肌发育过程也发挥举足轻重的作用。为筛选对骨骼肌发育起重要作用的miRNAs,本实验室之前用基因芯片检测胚胎期33天、胚胎期65天和成年的猪背最长肌中各种miRNAs的表达情况,最终找到140个差异表达的miRNAs。其中miR-29是上调倍数最高的miRNA之一;miR-195/497在骨骼肌生长发育过程也稳定上调。目前有研究表明miR-29影响肌肉发育,但由于骨骼肌的生长发育是一个复杂且长期的生物学过程,miR-29在骨骼肌生长发育的具体作用及机制尚不清楚；miR-195/497在骨骼肌中的作用少有研究。本研究利用小鼠个体以及可以分化成肌管、在体外模拟生肌过程的C2C12小鼠成肌细胞作为模型,来探讨miR-29和miR-195/497对骨骼肌生长发育过程中成肌细胞增殖和分化的具体作用,寻找它们发挥这些作用所涉及的靶基因或通路。取得了如下结果：(1)miR-29在猪和小鼠骨骼肌生长发育过程上调表达。Q-PCR结果表明miR-29c在猪E50d、E95d和成年骨骼肌中上调表达,与之前芯片结果相符。用Q-PCR检测miR-29在出生后各阶段的Balb/c小鼠腿肌中的表达情况,发现miR-29a/b/c在出生后2d的小鼠腿肌中表达相对较低,在出生后2w、4w和6w的小鼠腿肌中的表达逐渐升高,在出生后12w的腿肌中表达量最高,分别上调63.96、77.54和96.72倍；用Northern Blot对相同样品中miR-29c的表达情况进行验证,结果与Q-PCR结果一致。此外,本研究还对分化Od,1d、2d、4d和6d的C2C12细胞中miR-29c的表达进行Q-PCR检测,结果表明miR-29c在成肌细胞的体外分化过程中也是上调表达的。(2)miR-29抑制C2C12成肌细胞增殖。用pooled miR-29转染C2C12细胞,经过流式细胞仪分析发现处于G0/G1期的细胞比例比对照组显著增加(p<0.01),处于S期的细胞比例比对照组显著减少(p<0.01),同时细胞增殖指数比对照组也显著降低(p<0.01)。用xCELLigence系统实时定量监控C2C12细胞生长状态,发现pooled miR-29转染组细胞生长速度明显比对照组迟缓。用miR-29bc的超表达载体转染C2C12细胞后用EdU标记增殖细胞的DNA,经流式细胞仪分析发现miR-29bc转染组的双阳性细胞的比例比对照组显著降低(p<0.001)。(3)miR-29促进C2C12成肌分化。免疫荧光检测结果表明：经pooled miR-29转染后的C2C12细胞成肌分化进程加快,形成的肌管显著多于对照组(p<0.001)Q-PCR结果也表明pooled miR-29转染的细胞中分化标志基因MCK、MyHC和myogenin的表达也显著高于对照组(p<0.05)(4)miR-29通过结合Akt33’UTR调节其表达。经过TargetScan预测和功能筛选,选取Akt3作为miR-29的候选靶基因；经过双荧光素酶报告基因载体系统验证,证实了miR-29对Akt33’UTR的特异结合作用；经Western Blot分析,证实miR-29可以抑制Akt3蛋白在C2C12细胞中的表达。(5)Akt3促进成肌细胞增殖,抑制成肌细胞分化。用siRNA抑制C2C12细胞中Akt3的表达后,经流式细胞仪分析细胞周期发现,处于G0/G1期的细胞比例比对照组显著增加(p<0.01),处于S的细胞比例显著减少(p<0.001),同时细胞增殖指数也显著降低(p<0.01),说明Akt3对成肌细胞增殖起促进作用。细胞超表达Akt3后再进行诱导分化,免疫荧光结果证明细胞成肌分化受阻,形成的肌管比对照组显著减少(p<0.001);Q-PCR结果也证明,Akt3超表达的细胞中分化标志基因MCK、MyHC和myogenin的表达量显著低于对照组(p<0.05；p<0.001)。(6)超表达Akt3可以解除miR-29对成肌细胞增殖的抑制作用,减弱miR-29对成肌细胞分化的促进作用。miR-29转染C2C12细胞使细胞增殖指数显著降低(p<0.001),但当miR-29与Akt3共同转染时,滞留在G0/G1期的细胞显著减少(p<0.01),处于S期的细胞百分比显著增加(p<0.05),细胞增殖指数得到回升(p<0.01)。另一方面,在miR-29转染C2C12细胞后使分化标志基因MCK、MyHC、 myogenin的表达上调的基础上,超表达Akt3会造成分化标志基因的表达发生回落(MyHC, p<0.01; myogenin, p<0.05)。(7)发现一个存在于猪miR-29b-2/29c初始转录本上的T/C突变位点,Q-PCR结果证明此位点可以影响miR-29c在猪背最长肌中的表达；miR-29c对猪的YYl3’UTR有结合作用,这有可能是miR-29调节猪骨骼肌发育的重要途径。(8)miR-195/497在小鼠骨骼肌生长过程中呈上调表达,且miR-497抑制成肌细胞增殖。Q-PCR检测结果表明miR-195/497在出生后2d的小鼠腿肌中表达均相对较低,在出生后2w和4w的小鼠腿肌中的表达明显升高,在出生后6w的小鼠腿肌中表达最高,分别上调10.70和4.38倍。流式细胞仪分析结果表明miR-497转染组滞留在静息期的细胞较多(p<0.05),处在S期的细胞较少(p<0.05),并且细胞增殖指数比对照组低(p<0.05)。总之,本研究证明了miR-29对Akt3的调节作用是其调控骨骼肌生长和成肌分化的重要途径,发现了miR-195/497参与骨骼肌生长发育的直接证据。