研究目的通过构建pGenesil-3.1-HBx-shRNA载体和pHBLV-h-CCL20载体,转染入HepG2.2.15细胞,研究HBx沉默和h-CCL20过表达对HepG2.2.15细胞生长的影响,以期阐明两种基因参与肝脏恶性肿瘤发生发展的分子机制。研究方法(1)构建pGenesil-3.1-HBx-shRNA载体,通过电穿孔法转染HepG2.2.15细胞。(2)通过实时荧光定量PCR检测HBx、h-CCL20基因表达量差异;CCK8法检测细胞增殖活力;对各组细胞上清液中HBsAg和HBeAg进行检测;运用流式术对HepG2.2.15细胞的凋亡进行检测。(3)构建pHBLV-h-CCL20载体并转染HepG2.2.15细胞,在荧光显微镜下观察到有明显的绿色荧光,表明pHBLV-h-CCL20载体转染HepG2.2.15细胞成功。研究结果(1)成功构建pGenesil-3.1-HBx-shRNA载体和pHBLV-h-CCL20载体,且在HepG2.2.15细胞中能够成功的表达。(2)从实时荧光定量PCR结果知,已经成功转染了pGenesil-3.1-HBx-shRNA载体的HepG2.2.15细胞HBx基因的表达与转染空载体的HepG2.2.15细胞相比下降了28%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),从而说明shRNA对HBx基因的表达起到了抑制的作用。(3)用CCK-8法检测细胞增殖情况表明,HepG2.2.15细胞的增殖水平明显的受shRNA的抑制,细胞增殖水平下降了47%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(4)转染pGenesil-3.1-HBx-shRNA载体后,HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达量下降明显,HepG2.2.15细胞的凋亡明显增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),因此表明HBx基因在细胞凋亡过程中发挥作用。(5)pHBLV-h-CCL20载体在HepG2.2.15细胞中h-CCL20基因过表达,h-CCL20基因过表达在HepG2.2.15细胞凋亡过程中发挥促进作用。结论(1)利用RNAi技术,应用电穿孔法转染细胞,在HepG2.2.15细胞中,抑制HBx基因的表达,使上清液中HBsAg和HBeAg的表达量下降;对HepG2.2.15细胞的增殖起到抑制作用,促进细胞的凋亡。(2)pHBLV-h-CCL20载体在HepG2.2.15细胞中h-CCL20基因过表达,h-CCL20基因过表达在HepG2.2.15细胞凋亡过程中发挥促进作用,为h-CCL20基因的研究提供理论基础。