哺乳动物卵母细胞的正常发育是确保卵子成熟,受精以及胚胎发育的前提条件,是生命启始的物质基础。由于环境污染及自身老化等原因造成的卵母细胞质量下降,严重影响了动物繁殖力从而制约了畜牧业的发展。目前已有研究表明,许多在有丝分裂进程中发挥关键作用的分子都参与了卵子成熟和受精过程,其中有些分子的功能并不保守,在减数分裂中是特有的。此外,环境毒素和老化等外部因素影响卵子质量导致受精失败的作用机理也尚不明确。因此,系统开展对卵母细胞减数分裂成熟过程的内在调控机制和外在影响因素的研究,将有助于丰富和完善卵子发育成熟和卵子质量控制的理论基础,为提高家畜繁殖力提供可靠依据。本试验选用猪作为研究对象,通过对猪卵母细胞体外培养、体外受精、胚胎培养、荧光染色和免疫印迹等技术研究不同条件下猪卵母细胞质量变化的规律,探索卵母细胞成熟和受精的影响因素及调控机制。本研究共分为两个部分,首先发现环境毒素苯并芘(Benzo(a)pyrene,BaP)通过诱导卵子产生氧化应激和细胞早期凋亡损害猪卵母细胞成熟和受精过程,并证明褪黑素作为天然抗氧化剂能有效改善苯并芘诱导的卵子质量低下。此外,本课题还阐明了排卵后老化过程通过破坏卵子成熟和受精过程的关键事件及调控因子影响卵子质量的机理。主要研究结果如下:试验一、苯并芘诱发猪卵母细胞减数分裂异常的机制及褪黑素的保护作用本研究通过体外培养过程中添加不同浓度BaP的方式观察和记录卵母细胞成熟率及影响成熟的各种细胞器的变化。试验发现50μM BaP暴露显著降低了卵母细胞的排极体率和卵丘扩展程度。通过细胞免疫荧光染色发现BaP暴露引起卵母细胞内纺锤体组装异常,并激活纺锤体检验点蛋白BubRl,从而抑制第一极体排出,降低卵母细胞的成熟率。另外,BaP暴露还损害了微丝骨架和线粒体的定位以及皮质颗粒的分布和释放。结果显示BaP处理卵母细胞后皮质颗粒会提前释放内容物至细胞外,而作为皮质颗粒的成分之一,ovastacin也会随之释放并提前行使切割透明带中精子结合位点的功能,导致透明带结合精子能力下降,严重影响卵子的受精率并造成受精失败。同时,作为卵子质膜上负责精卵融合的关键蛋白Juno也受到BaP暴露的损伤。通过荧光染色和定量分析发现Juno的表达量及定位都受到不同程度的影响,这也是造成受精失败的另一个因素。已有研究报道BaP暴露会诱导氧化应激从而影响细胞发育,因此为了探究BaP对卵母细胞造成损伤的原因,本试验对卵母细胞内活性氧(ROS)的含量做了荧光染色分析,结果发现BaP暴露会显著增加卵子内氧化应激的水平,高水平的ROS又会引发细胞早期凋亡造成卵母细胞内各种细胞器发生定位和功能衰退现象。鉴于褪黑素是一种存在于卵泡液中的有效抗氧化剂,本试验也证明了褪黑素可以降低由BaP引起的ROS水平和卵母细胞凋亡率,从而挽救BaP暴露引起的各种卵母细胞减数分裂异常。综上得出,长期暴露在高浓度BaP环境中,会严重影响雌性生物卵子的质量,并对卵母细胞的受精能力造成一定的损伤。试验二、老化诱导氧化应激损害猪卵母细胞质量的机制研究本研究选用猪作为实验动物模型,探究卵子老化在家畜繁殖中的潜在影响。本试验将猪的卵母细胞分成三组,第一组作为对照组,体外培养44小时之后观察记录卵母细胞正常的成熟率及细胞形态变化。第二组体外培养68小时,即排卵后老化24小时的实验组。第三组体外培养92小时,即排卵后老化48小时的实验组。然后观察实验组卵母细胞随着体外老化时间的延长造成的卵子形态变化,并通过细胞免疫荧光技术结合荧光强度分析软件分析细胞内各种细胞器的定位与动态变化的差异。试验结果发现,体外培养猪卵母细胞老化过程中卵丘细胞与卵母细胞结合逐渐松散,同时卵母细胞碎裂率也随着体外老化时间的延长逐渐升高,引发猪卵母细胞形态学发生改变。此外,老化过程也会干扰细胞器的功能与结构,其中包括纺锤体的组装、肌动蛋白的聚合和线粒体的分布等,这些都严重影响卵母细胞发育,进而导致卵母细胞质量下降。值得注意的是,老化过程中皮质颗粒分布也发生明显变化。随着老化程度的不断加强,皮质颗粒逐渐被提前释放到细胞外,皮质颗粒的内容物也随之排出,其中包括能够切割透明带精子结合位点的ovastacin,从而影响精子与卵子的结合,降低受精能力。进一步研究发现活性氧(ROS)在老化的卵母细胞内不断积累,氧化应激水平与对照组相比显著增高,卵母细胞凋亡率的升高,导致卵母细胞发育异常。综上得出,排卵后老化通过诱导氧化应激引起猪卵母细胞成熟过程中各种分子水平和细胞水平的变化,损害了卵子成熟和受精能力。总之,无论是环境毒素BaP或者排卵后老化,都会引发卵母细胞内氧自由基(ROS)水平的升高,造成氧化应激,导致细胞内各种细胞器表达与定位出现异常。长时间暴露在BaP环境中,或者不断延长排卵后老化的时间都将严重降低卵母细胞的质量,导致皮质颗粒的提前释放,引发透明带上精子结合位点被过早切除而降低精卵结合能力,最终降低受精率。