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如今大量研究证实,细胞凋亡参与了中枢神经系统多种疾病(如卒中、脑外伤)后的细胞死亡,并与继发性脑功能障碍密切相关。B细胞淋巴瘤／白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)作为主要的凋亡抑制蛋白,对脑细胞具有明显的保护作用。在神经干细胞移植技术日渐成熟的基础上,结合基因工程技术使外源性Bcl-2在神经干细胞中过量表达,可以增强干细胞在移植部位不良微环境下的耐受能力,有效抑制凋亡的发生,从而提高移植后神经干细胞的存活率,为以后细胞与周围神经组织的整合以及神经功能的恢复打下良好的基础。本实验旨在构建一种含有Bcl-2和水母绿色荧光蛋白(Aequorea coerulescens green fluorescent protein, AcGFP1)基因的重组表达质粒pAcGFP1-IRES2-Bcl2,并以此转染体外培养的大鼠胚胎皮质神经干细胞(Cortex-Derived Neural Stem Cells, cNSCs),最终建立Bcl-2和AcGFP1基因修饰的cNSCs,为下一步开展细胞移植治疗卒中、脑外伤等中枢神经系统疾病的研究奠定基础。目的：构建大鼠重组表达质粒pAcGFP1-IRES2-Bcl2;建立Bcl-2和AcGFP1基因修饰的大鼠胚胎皮质神经干细胞(cNSCs)。方法：采用RT-PCR方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出Bcl-2基因编码序列的cDNA,纯化后克隆到载体pMD19-T Simple Vector中,经PCR-凝胶电泳和测序分析对重组克隆质粒pMD19-Bcl2进行鉴定,再将质粒上的目的基因亚克隆到真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,经酶切-电泳对重组表达质粒pAcGFP1-IRES2-Bcl2作进一步鉴定；选择孕13天的SD(Sprague-Dawley)大鼠,取其胎鼠并从大脑皮层中分离神经干细胞,在含有FGF-2、EGF、N2和B27的DMEM/F12培养基中筛选培养,当传至第三代时进行免疫荧光鉴定;采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将重组表达质粒pAcGFP1-IRES2-Bcl2转染至培养的神经干细胞中,在含有G418的培养基中筛选培养,荧光显微镜下观察AcGFP1的表达情况,Western-Blot鉴定Bcl-2的表达。结果：大鼠Bcl-2基因编码序列cDNA正确克隆到真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,从而成功构建了大鼠重组表达质粒pAcGFP1-IRES2-Bcl2;从E13天的SD胎鼠的脑皮质分离出的细胞能在培养基中稳定增值并连续传代,免疫荧光鉴定Nestin为阳性,细胞分化后分别鉴定NSE、GFAP和GalC也都呈阳性,表明细胞已分化为神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞,证明培养的细胞是神经干细胞；基因转染神经干细胞24h后开始表达绿色荧光蛋白,Western-Blot结果表明Bcl-2能在干细胞中正确表达。结论：成功构建了大鼠重组表达质粒pAcGFP1-IRES2-Bcl2,并采用质粒转染的方式建立了Bcl-2和AcGFP1基因修饰的大鼠胚胎皮质神经干细胞,为下一步开展细胞移植治疗卒中、脑外伤等中枢神经系统疾病的研究奠定基础。