论文部分内容阅读
肌肉的生长发育一直是发育生物学研究的热点问题。近年来,miRNA被发现参与肌肉的生长发育过程。绵羊作为一种重要的家畜,能为人们提供高质量的肉产品。对绵羊肌肉生长发育的研究,有助于提高其产肉性能。本研究通过在体外细胞水平诱导骨骼肌卫星细胞(satellite cells,SCs)的成肌分化模拟肌肉的生长发育过程,以建立的成肌分化模型为基础研究mi R-192在细胞增殖和成肌分化过程中的功能。本研究首先分离绵羊骨骼肌SCs,建立体外诱导成肌分化体系。然后对绵羊不同生长阶段的肌肉组织和SCs成肌分化过程中miR-192的表达情况进行了研究,通过在SCs内过表达和抑制表达miR-192研究其对成肌分化和增殖的影响。最后,利用双荧光素酶报告基因实验(dual-luciferase assay)验证了RB1是miR-192的一个靶基因,进一步的RB1干扰试验证实了RB1在成肌分化过程中的作用。主要结果如下:(1)分离绵羊骨骼肌SCs。对SCs进行鉴定,并对其纯度进行检测。结果表明,本试验成功分离绵羊骨骼肌SCs,可在体外稳定传代,纯度较高(>90%);(2)本研究基于分离得到的绵羊骨骼肌SCs和小鼠C2C12成肌细胞建立两种细胞体外成肌分化体系。结果表明,在本试验的分化体系下绵羊骨骼肌SCs和小鼠C2C12成肌细胞都能分化成为特征明显的肌管,并伴随着成肌标记基因肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)和肌细胞生成素(myogenin,MyoG)的表达;(3)对SCs成肌分化过程中和处于不同生长阶段的绵羊骨骼肌中miR-192的表达谱进行了检测。发现miR-192在SCs成肌分化过程中呈现下调表达,在绵羊胎儿时期的表达量高于成体期,而且miR-192在羔羊的多个组织中均有表达;(4)通过在细胞内瞬时过表达和抑制表达miR-192的方法来研究miR-192对成肌分化的影响。在确认成功过表达和抑制表达miR-192的前题下,利用western blotting、定量PCR和细胞免疫荧光等方法检测过表达和抑制表达miR-192对成肌分化标记基因的影响。结果发现过表达miR-192抑制成肌分化标记基因(MHC和MyoG)的表达,抑制表达miR-192促进成肌分化标记基因的表达,说明miR-192对成肌分化具有抑制作用。本研究进一步利用EdU和MTT细胞增殖检测方法检测过表达和抑制表达miR-192对细胞增殖的影响。结果发现过表达miR-192促进SCs的增殖,抑制表达miR-192减弱SCs的增殖,说明miR-192对SCs的增殖具有促进作用。(5)通过靶基因预测软件发现RB1是miR-192一个潜在的靶基因。随后通过双荧光素酶实验(dual-luciferase assay)和western blotting证实miR-192靶向RB1的3’-UTR抑制RB1的表达。进一步si-RB1试验发现RB1的表达干扰显著抑制绵羊骨骼肌SCs成肌分化但对其增殖具有促进作用,从而证实RB1在成肌分化和细胞增殖过程中扮演的重要作用。综上,miR-192通过靶向RB1的3’-UTR抑制绵羊骨骼肌SCs的成肌分化但促进SCs的增殖。