背景和目的癌症是严重威胁人类健康的重大疾病。据最新评估185个国家的36种癌症发现,新发病例和死亡病例分别为1810万和960万[1]。为减少癌症发病率和致死率,急需寻找更多更为有效的诊断和治疗方法。研究发现,基因组的异常是癌症的特征和进展的标志,癌症的基因组异常是所有疾病中最为复杂的,包括染色体增加、缺失及点突变[2]。随着现代分子生物学的发展,分子检测被广泛应用,但常规的分子检测依旧以肿瘤组织活检为“金标准”,采用原发灶或单一转移灶的肿瘤组织获取DNA或RNA来检测基因突变。由于肿瘤异质性,单一肿瘤组织活检后进行基因组测序不能捕获全部肿瘤基因谱,不能代表完整的肿瘤信息[3],而且组织活检有很多局限,例如:可利用组织少、难以多次取样、侵袭性取样过程可能增加病人的风险[4]。液态活检(Liquid Biopsy)与肿瘤组织分子检测相比,有迅速、便捷、损伤性小等众多优点,从长远角度来看,液态活检可以用来检测肿瘤对治疗的反应,预测肿瘤复发甚至是帮助医生在患者未出现任何症状的时候发现初期肿瘤,实现早期诊断。从血液中游离的DNA片段中取得的基因组信息甚至可以指出体内肿瘤发源的部位。因此基于血液的液态活检技术对于癌症的诊断、治疗及预后都有很大的潜在价值。循环肿瘤DNA(ct DNA,circulating tumor DNA)是近年来液态活检技术的热门研究对象之一。血液或其它体液中游离的DNA片段,称为cf DNA(cell free DNA),其中肿瘤来源的cf DNA片段为ct DNA。研究表明血浆cf DNA中ct DNA可用于多种癌症的检测和预后判断。为增加ct DNA的检测灵敏度,多项实验和数据分析方法已用于评估ct DNA,包括片段大小选择、分子标记等[5,6]。最新文献报道在细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)中发现ct DNA,EVs可富集ct DNA[7-9]。外泌体(exosome)是EVs的一个重要亚型,也是肿瘤液态活检领域的另一重要检测物。外泌体提取方法包括多种:传统的差速离心、密度梯度离心、超滤法及试剂提取法等。到目前为止,对ct DNA的研究局限于整体血浆或血浆的某个部分(如EVs),很少有研究将ct DNA的富集和外泌体的提取方法结合起来,系统的检测并比较血浆不同组分对ct DNA含量的影响,基于外周血不同组分建立ct DNA的分离、富集方法。外泌体是直径大约为30-150 nm的具有脂质双层膜的囊泡状小体。外泌体表面包含的脂膜成分,使得其内含物中的蛋白和RNA等免受各种酶的降解,具有较高的稳定性[10]。研究发现疾病来源的外泌体中多类生物活性分子均存在差异性表达,其中外泌体micro RNA受到广泛研究,血清外泌体某些特定mi RNAs被报道可作为各种恶性肿瘤的诊断、预后甚至治疗的生物标志物[11-13]。我们前期研究发现循环外泌体mi R-27a和mi R-130a可作为CRC新的诊断和预后的标志物[14],但是循环外泌体中与CRC肝转移关联的特定mi RNAs研究甚少。基于以上研究背景,本课题第一部分拟通过分离血浆不同组分,将cf DNA的分离与外泌体的提取结合起来,进一步建库、测序及生物信息学分析,建立ct DNA分离富集的方法;第二部分提取CRC病人的外周血外泌体,结合数据库分析选择特定的mi RNA,检测外泌体特定的mi RNA表达,寻找CRC肝转移病人的诊断和预后相关标志物。第一部分基于外周血不同组分的ct DNA富集方法的建立方法:1.本研究选取9个ct DNA高的小细胞肺癌病人,通过物理、化学沉淀5步连续离心方法将血浆分成多个组分;2.通过透射电镜分析、纳米示踪分析及流式细胞特征蛋白分析对组分3、组分6进行评估和鉴定;3.提取样本DNA,对不同样本6个组分进行DNA产量、大小分布检测;4.通过建库、全基因组测序、生物信息学分析,基于前期建立的新的拷贝数算法,分析不同组分ct DNA含量并与传统cf DNA中ct DNA含量进行比较。结果:1.成功分离1 ml血浆为6个组分:组分1是细胞及大碎片,组分2是碎片和大囊泡,组分3是大的微囊泡,组分4是纤维蛋白,组分5是外泌体,组分6是5步离心后的上清,合计54个样本;2.产量不同:组分1、5、6的平均产量居于前3位,占DNA总产量的79.9%,它们的产量变化也是在前三位,相反,组分2、3、4的DNA产量少但是相对稳定;3.6个组分DNA大小分布不同:大片段(～10,000 bp)从组分1-3逐渐变浅,小片段(～160 bp)从组分4-6逐渐增加,并在某些样本,组分6出现140 bp左右片段;4.建库测序成功:平均每个样本得到大约2千万(范围在0.94-4.21千万)的匹配读数(mappable reads),匹配率88.0%(范围在71.9%-91.0%);5.6个组分中,经5步离心后的上清的拷贝数变化最大、ct DNA含量最高,第二是外泌体、第三是大的细胞外囊泡;6.与传统法不分组分提取的cf DNA相比,分组分法得到的组分6上清拷贝数变化更大,可以富集更多的ct DNA。结论:本课题为血浆不同组分的DNA片段大小和ct DNA含量研究提供了新的思路,血浆经多步连续离心后的上清比传统cf DNA中含有更多的ct DNA。第二部分循环外泌体mi R-122作为CRC肝转移的临床诊断及预后标志物研究方法:1.综合分析GEO数据库中CRC临床样本mi RNA结果,选择差异mi RNA;2.从血清和细胞培养上清中提取外泌体,并通过透射电镜分析和免疫印迹进行鉴定;3.QRT-PCR检测选定mi RNA在细胞、组织、血液及外泌体中的表达水平,并在CRC队列进行验证,同时收集了患者的临床病理信息与预后随访信息;4.ROC曲线分析用于判断外泌体mi RNA对CRC的诊断价值;5.Cox回归模型及Kaplan-Meier生存曲线分析外泌体mi RNA的表达与临床病理参数及患者预后的相关性。结果:1.综合分析GEO数据库临床样本mi RNA表达结果发现,mi R-122在CRC病人组织中显著高表达,特别是在CRC肝转移病人中;2.mi R-122在CRC病人组织样本和各种CRC细胞中显著高表达;3.mi R-122在CRC病人血清中显著上调,CRC病人血清中上调的mi R-122由肿瘤释放,并通过外泌体传递;4.血清外泌体mi R-122在CRC病人中显著上调,特别是在CRC伴肝转移病人中;5.血清外泌体mi R-122差异表达结果和ROC曲线分析显示血清外泌体mi R-122可用于区分CRC伴肝转移病人、健康人、CRC不伴肝转移病人,AUC值分别为0.89、0.81;6.CRC病人,特别是血清外泌体mi R-122高表达的CRC伴肝转移病人总生存期短,预后差;7.单因素及多因素分析显示血清外泌体mi R-122表达水平及肝转移状态均是CRC病人总生存期的独立预后因子。结论:血清外泌体mi R-122可作为CRC肝转移的新的潜在的诊断和预后标志物。