论文部分内容阅读
目的：通过在常氧条件下培养正常肝细胞系和肝癌细胞系,观察分化型胚胎软骨发育基因1(differentiated embryo-chondrocyte expressed genel, DEC1)在两者中的表达差异,探讨DEC1在肝癌发生发展中的作用；通过在缺氧条件下培养肝癌细胞系,研究缺氧环境对缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1a, HIF-1a)和DEC1表达的影响；通过应用抑制剂抑制HIF-1α蛋白的表达,检测DEC1表达的变化,探讨缺氧时肝癌细胞中HIF-1α对DEC1表达的调控作用。方法：1.常氧细胞培养：人正常肝细胞系QSG-7701,人肝癌细胞系BEL-7402、 SMMC-7721细胞均用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基,置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。待细胞处于对数生长期时收集细胞用于RT-PCR和Western blot实验。2.缺氧细胞培养：将人肝癌细胞系BEL-7402、SMMC-7721用含有200μM CoCl2的RPMI1640培养基进行不同时间的化学模拟缺氧培养(0、2、4、6、24和48h),收集各组细胞用于RT-PCR和Western blot实验。3.YC-1抑制培养：将人肝癌细胞系SMMC-7721用含200μM CoCl2和50μMYC-1的RPMI1640培养基进行抑制培养,同时设缺氧对照组(培养基中只加CoCl2,不加YC-1)及常氧对照组(培养基中不加CoCl2和YC-1),培养4h后收集各组细胞用于RT-PCR和Western blot实验。4.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各实验组细胞HIF-1α、DEC1mRNA水平的表达。5.蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各实验组细胞HIF-1α、DEC1蛋白水平的表达。6.应用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学处理,计量资料以x±s表示,两组间比较用独立样本t检验,多组间比较行单因素方差分析,进一步的两两比较应用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.常氧实验结果显示：正常肝细胞系QSG-7701及肝癌细胞系BEL-7402、 SMMC-7721中均可检测到DEC1mRNA和蛋白的表达。肝癌细胞系DEC1的表达水平明显高于正常肝细胞系,P<0.05,差异有统计学意义。2.缺氧实验结果显示：缺氧不同时相HIF-1α mRNA表达无明显变化(P>0.05),但随缺氧时间延长,HIF-la蛋白、DEC1mRNA及DEC1蛋白表达均显著增加(P均<0.01)。3.抑制实验结果显示：HIF-1α mRNA在抑制培养组、缺氧对照组及常氧对照组均有所表达,但表达无明显差异(P>0.05)。HIF-1α蛋白、DEC1mRNA及DEC1蛋白在抑制培养组表达均较缺氧对照组明显降低(P<0.01)。结论：1.本研究自mRNA水平和蛋白质水平证实肝癌细胞系中DEC1表达明显高于正常肝细胞系,提示DEC1在肝癌的发生发展中可能具有重要作用。2.利用CoCl2缺氧模型,本研究首次证实缺氧可以诱导肝癌细胞系HIF-1α蛋白、DEC1mRNA及DEC1蛋白的高表达,并且在长时间缺氧(24h、48h)的情况下,DEC1及HIF-1α的表达仍维持在较高的水平,这些均提示两者对肝癌细胞适应缺氧微环境起着重要作用。3.本研究应用HIF-1α蛋白抑制剂进一步明确了DEC1与HIF-1α之间的关系,实验结果显示缺氧可能通过上调HIF-1α蛋白的表达诱导肝癌细胞中DEC1的高表达。