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研究背景与目的:肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全世界第二大癌症致死的主要疾病,其中有一半的肝癌诊断和死亡发生在我国。研究证实肝癌的发生、发展是多步骤的,很多异常表达的基因在影响肝细胞恶性转化的过程中起了关键作用,这些基因参与细胞生命进程的各个关键环节,如细胞周期的控制,细胞生长、凋亡及细胞的迁移和扩散。针对肝癌的发生发展,筛选鉴定与肝细胞恶性转化密切相关的分子靶标将可能为临床上肝癌患者开发潜在的治疗靶点。近几年,cDNA微阵列(基因芯片)技术的出现及发展,为在全基因组内寻找与肿瘤等疾病发生、发展相关的差异性表达的基因提供了一个强有力的手段。在本研究中,我们将使用Affymetrix公司的Human Geome U133plus2.0基因表达谱芯片在人类全基因组范围内检测、比较肝癌患者肿瘤组织及癌旁正常肝组织基因表达谱的差异,获得二者的差异表达基因,利用生物信息学的初步挖掘,筛选出有关的功能基因作为潜在的分子靶标,从而获得更多与肝癌发生转化相关的分子机制的生物学信息。本实验旨在全基因组范围内筛选肝细胞癌的相关致病基因,初步研究目的基因对肝癌细胞的增殖、凋亡的影响,开发肝癌潜在的治疗靶点。第一章利用基因芯片技术筛选肝癌组织中的差异表达基因研究目的:通过Affmetrix基因表达谱芯片技术研究肝癌组织与癌旁正常肝组织之间的基因差异表达谱,筛选出进一步研究的致病基因。方法:收集2013年5月至2013年12月期间在南昌大学第二附属医院肝胆外科进行肝癌手术并经病理学检查证实的原发性肝癌病人的组织标本,建立了肝癌标本库,并按标准流程进行标本的采集、处理、保存等。本研究经过南昌大学第二附属医院伦理委员会批准,并通过受试对象的知情同意。在肝癌标本库中随机选取了手术切除的肝癌组织及癌旁正常肝组织共10对采用Affmetrix基因表达谱芯片进行分析:提取总RNA,质量检定基本合格后,对RNA进行荧光标记,芯片杂交,清洗,用GeneChip Scanner3000扫描仪扫描芯片,得到杂交芯片的图像资料,用GeneChip Operating software (GCOS)图像分析软件对扫描得到的原始图像进行分析处理,得到芯片上两种样本各点的杂交信号强度值以及其信号强度比值。比值大于或等于2时,我们认为两样本之间是有显著差异的。结果:总RNA质检结果:10组样品总RNA的质量可靠,可入选用于下一步的芯片杂交实验。经cDNA微阵列基因芯片初步筛选,结果由SAM软件分析处理,得到肝癌组织和癌旁正常组织的差异表达基因:相对癌旁正常肝组织,在肝癌组织中共有93个基因表达显著上调;68个基因表达明显下调。结论:1、肝癌与正常肝组织之间存在明显差异表达的mRNA,这些差异表达的基因可能在肝癌的发生发展中发挥重要作用,可能成为新的肝癌分子标记物或潜在的治疗靶点。2、EIF3B过表达与肝癌的发生发展相关。第二章EIF3B抑制肝癌SMMC-7721细胞株增殖的研究研究目的:通过一系列的体外细胞功能实验,研究EIF3B对肝癌细胞增殖的作用,以便进一步了解EIF3B在肝癌中的生物学功能。方法:找吉凯基因公司构建EIF3B的干扰RNA,利用慢病毒包装转染至肝癌SMMC-7721细胞株。实验分为两组:1、阴性对照组(Negative Control),为正常目的细胞、加阴性对照病毒感染的细胞组;2、EIF3B-siRNA组,为正常目的细胞、加EIF3B-siRNA慢病毒感染的细胞组。应用细胞计数、平板克隆形成实验观察EIF3B下调对肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响,通过流式细胞术分析EIF3B下调对肝癌SMMC-7721细胞周期的影响。结果:1、细胞计数结果显示:EIF3B-siRNA组与对照组比,活细胞数目明显减少(P<0.05),增殖能力受到抑制;2、平板克隆形成实验结果显示:EIF3B-siRNA组与对照组相比,细胞克隆形成数目显著减少(P<0.01),说明EIF3B表达促进了肝癌SMMC-7721细胞的增殖;3、流式细胞术结果显示:转染EIF3B-siRNA后肝癌细胞G0/G1期减少,S期G2/M期增多,说明出现细胞周期进展,肿瘤细胞增殖增多。结论:1、下调EIF3B可抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖。2、EIF3B可能影响细胞周期相关的通路促进肝癌细胞增殖。