龟类在动物界中属于脊索动物门、脊椎动物亚门、爬行纲、龟鳖亚纲、龟鳖目。龟类在进化史上属于活化石类的生物,以长寿而闻名,具有超强的耐低温和耐缺氧特性。耐低温耐缺氧机理研究具有非常重要的意义,例如在细胞冷冻过程中防止细胞被冰晶损伤,在器官移植手术中,离体器官长期保存而不会出现缺血/缺氧而造成的衰竭,保证再充血再充氧这样的再灌注过程中不被大量产生的自由基损伤,提高被远距离运送的重伤员的成活率等,甚至还有些仿生学科学家希望通过将人体通过类似的低温低氧“窖藏”的方式来延长生命。龟类具有一些非常特殊的身体结构,其红细胞尤为特殊。龟类红细胞像大多数低等脊椎动物的红细胞一样为椭圆形,体积大且有核,不同之处在于成熟的龟类红细胞不含有线粒体。有的研究者指出龟类红细胞在进化史上与哺乳动物最接近,所以,可以把龟的红细胞定位于低等脊椎动物与高等脊椎动物红细胞之间。但是到目前为止,科学界对龟类红细胞的组成,尤其是对细胞保护,信号转导,物质运输有重要意义的细胞膜的组成知之甚少。如此特殊的红细胞结构及其与龟类超强的抗缺氧抗应激耐力的关系是本研究探讨的关键科学问题。本文以蛋白质组学及相关技术对巴西红耳龟血影的全蛋白质组学进行了研究,并发现了一些与巴西红耳龟低温缺氧耐受直接相关的蛋白,进而研究了其在巴西红耳龟低温缺氧过程中可能发挥的作用及作用机理。首先,本文以巴西红耳龟(Red-eared turtle, Trachemys scripta)为研究材料,着眼于如何获得高纯度的巴西红耳龟红细胞血影,由于巴西红耳龟红细胞既有类似体细胞的复杂性,其细胞膜又具有哺乳动物红细胞的脆弱性,以至于分离体细胞的剧烈细胞破碎方法和分离哺乳动物红细胞的相对温和的低渗裂解法都不适用于分离龟类的红细胞。所以,纯化其红细胞血影是一项挑战。在本研究之前,未发现有详细的关于如何分离纯化巴西红耳龟红细胞血影的方法。本实验室在已有的研究报道的基础上通过反复摸索,最终总结出了一套有效的分离方法,通过富集红细胞,低渗裂解,具特殊针头注射器的吹打,低速匀浆以及差速离心的方法,我们最终获得了满足蛋白质组学鉴定要求的血影。并通过4种不同的样品前处理与不同的质谱鉴定方法相结合,介绍了一套有效的巴西红耳龟红细胞血影的蛋白质组学分析方法,共鉴定得到169个非冗余蛋白质并对其中有意义的蛋白质进行了深入的探讨,发现了一些与巴西红耳龟超强耐力相关的蛋白,如微管蛋白,热休克蛋白,以及定位在“红细胞膜上”的与产能直接相关的蛋白——F型ATP合酶亚单位。红细胞“非线粒体微生物样供能”为巴西红耳龟的抗逆生存机理研究打开了一个全新的视野。其次,我们对巴西红耳龟进行了一周低温潜水处理,测定了一些与能量代谢相关的关键生化指标,发现了巴西红耳龟在短期低温潜水期间无氧糖酵解与糖异生同时进行的能量代谢方式。对短期低温潜水期间巴西红耳龟体内肝糖原和肌糖原储备没有被消耗而血糖升高的现象作出了独特的阐释。最后,我们结合短期低温潜水期间能量代谢的特点以及前人的研究基础,进行了血液体外ATP剥夺实验,证实了巴西红耳龟红细胞具有向细胞外产生ATP的特性。可能的产能机理是红细胞利用细胞内比细胞外高出约5倍的氢离子推动细胞膜上的ATP合酶合成ATP。并在此基础上提出了巴西红耳龟短期低温潜水期间的能量代谢模型假说。总之,本研究从巴西红耳龟血影的分离纯化到血影蛋白的高效酶切,再到质谱鉴定,生物信息学分析,系统地提出了一套针对巴西红耳龟甚至是有核红细胞血影的组学分析方法。同时,对巴西红耳龟短期低温缺氧能量代谢机理进行了探讨,发现巴西红耳龟红细胞除了携带氧的作用外,还可能具有供能作用。本课题的研究发现为今后更加深入地研究巴西红耳龟以至整个龟类的能量代谢机制和低温缺氧应对机制提供了全新的有重要进化生物学价值和临床医学意义的实验数据和理论假说。