乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染会引起慢性肝炎、肝硬化及细胞癌等肝脏疾病,全球每年约有100万人死于乙肝病毒感染引起的肝脏疾病。虽然乙肝疫苗的广泛应用在很大程度上预防了乙肝病毒的传播,然而慢性乙肝的治疗一直处于困境。目前公认有效的治疗药物主要为核苷酸类似物,但核苷酸类似物仅能暂时降低患者血清中的病毒载量,甚至有停药后再度暴发的风险。这主要是因为目前临床上的治疗方法均不能清除乙肝慢性感染和复发的根源,也就是肝细胞内乙肝病毒的共价闭合环状DNA(ccc DNA)和HBV在复制过程中整合至宿主细胞基因组上的整合状态HBV DNA。因此,探寻从根本上清除HBV的方法成为治疗慢性乙肝的当务之急。近年来基于细菌获得性免疫系统CRISPR开发出的CRISPR-Cas9基因编辑技术几乎可以对任何物种进行DNA的精确编辑,这一方便、快捷的技术使得从根本上清除HBV ccc DNA和整合状态的HBV DNA成为了可能。在本研究中,我们首先利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在HBV细胞模型以及HBV小鼠模型中实现了对乙肝病毒复制根源HBV ccc DNA的靶向剪切以及对乙肝病毒复制与表达的高效抑制。随后,我们又利用该技术在清除HBV ccc DNA的同时,完全清除了HBV细胞模型中全长整合的HBV基因组,实现了对感染细胞中HBV更加彻底的清除。最后,为了检测CRISPR-Cas9在清除HBV过程中对细胞基因组造成的影响,我们利用全基因组测序技术评估了感染及清除HBV前后宿主细胞基因组的变化,并首次发现了宿主细胞基因组上有大量SNP会随着HBV的清除而恢复至HBV感染前的类型。1.CRISPR-Cas9抑制HBV复制与表达的研究(1)剪切HBV DNA的高效gRNA靶点筛选由于HBV基因组变异位点较多,开放阅读框高度重叠,且宿主细胞中存在多种形式的HBV DNA,为了筛选出能够高效剪切HBV基因组的g RNA靶点,我们通过生物信息学比对以及对CRISPR-Cas9剪切活性的检测,从8个候选g RNA中筛选出了对HBV DNA剪切及抑制效率最高的g RNA-S4靶点。通过深度测序,我们证实了该系统对HBV基因组的剪切作用并评估了该系统的剪切效率。(2)利用gRNA-S4系统高效抑制细胞及小鼠体内HBV的复制与表达我们利用HBV稳转细胞系Hep G2.A64以及HBV高压水动力小鼠分别作为模型,分别检测了g RNA-S4在体内、外对HBV复制的抑制效果。结果显示,g RNA-S4在细胞中高效抑制了HBV复制与表达并将HBV ccc DNA含量降低了95.37±0.64%。我们还利用该系统将HBV高压水动力小鼠血清中的HBs Ag含量降低了99.92±0.04%,将小鼠血清中的HBV DNA降至了阴性临界值以下。(3)CRISPR-Cas9靶向HBV的特点分析在上述实验中,由于细胞中存在多种形式的HBV DNA,其中环状HBV DNA在CRISPR-Cas9剪切后即降解。因此,我们在研究中发现CRISPR-Cas9对细胞中HBV的剪切效率实际上要远低于对HBV表达的抑制效率。此外,由于HBV基因组编码区的高度重叠,我们仅用破坏一个位点便可抑制HBV全部基因的表达。2 CRISPR-Cas9清除整合状态HBV DNA的研究HBV在感染过程中会将病毒基因组整合到宿主细胞染色体上,而这些整合的HBV DNA被认为是肝细胞癌发生的重要因素,会引起宿主基因组的变异进而改变细胞增殖与分化相关基因的表达。同时,实验室常用的HBV转基因细胞模型中除了含有HBV ccc DNA均整合有HBV的全长基因组,且全长整合的HBV DNA是稳转细胞模型中HBV复制与表达的主要模板。因此,为了实现对HBV感染的清除,除了靶向降解HBV ccc DNA之外,我们还必须清除细胞染色体上全长整合的HBV DNA。由于HBV稳转细胞中的乙肝病毒生活周期及复制模式与实际情况类似,均存在HBV ccc DNA和HBV复制中间体等多种形式的HBV DNA。因此利用CRISPR-Cas9在HBV稳转细胞模型中清除全长整合的HBV DNA同样能够很好地模拟真实感染中清除HBV DNA整合片段的过程。(1)建立了特异性扩增HBV稳转细胞中全长整合HBV DNA的新方法由于HBV细胞模型中HBV整合位点较多,且细胞内存在多种形式的HBV DNA,利用Alu-PCR以及细胞全基因组测序均难以定位出全长整合HBV基因组的具体位置。在本部分实验中,我们建立了一种特异性扩增HBV稳转细胞模型中全长整合HBV基因组的新方法,即利用HBV全长整合位点3’端外源启动子特异性引物,实现对细胞基因组中全长整合HBV基因组的扩增。(2)首次清除HBV稳转细胞中全长整合的HBV DNA我们利用靶向全长整合HBV基因组两端侧翼序列的gRNA-69系统成功清除了细胞中全长整合的HBV基因组。在清除细胞中全长整合的HBV DNA后,细胞中的HBV ccc DNA、HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA在连续300天的培养中均无法检出。这部分结果表明,我们首次利用CRISPR-Cas9系统清除了细胞内的HBV感染。3清除HBV前后宿主细胞全基因组测序及分析(1)清除HBV感染后细胞基因组中HBV整合位点大量消失为了探究CRISPR-Cas9在清除HBV的过程中对宿主细胞基因组可能造成的影响,我们对HBV清除前后的细胞株以及HBV整合前的Hep G2细胞株分别进行了全基因组测序。通过对3株细胞HBV整合位点的分析,我们发现相比清除HBV前的细胞Hep G2.A64,清除了HBV后的69-7细胞基因组中HBV的随机整合位点减少了97.7%。(2)清除HBV感染后细胞基因组中大量SNP恢复至HBV感染前状态通过对HBV感染及清除前后3个细胞基因组上突变尤其是SNP的分析,我们发现,HBV感染后的A64细胞中共有2,284,202个SNP位点发生了变异,而其中的2,093,238的SNP位点在HBV被清除后恢复成了HBV感染前的状态。(3)排除CRISPR-Cas9脱靶效应及细胞污染的可能性为了进一步探究清除HBV感染后宿主细胞基因组突变恢复的原因,我们首先利用同源序列分析了g RNA的脱靶效应,证实了g RNA-69不存在明显的脱靶效应。然后通过对HBV整合位点的分析,证实了清除HBV后的69-7细胞并非此前HBV感染细胞A64中污染的Hep G2细胞。最后通过对g RNA-69剪切后的残余序列进一步分析,证实了清除HBV后的69-7细胞并非g RNA-69转染之前存在于A64细胞中的亚克隆,而是g RNA-69剪切A64细胞中HBV后所形成的细胞克隆。这部分结果否定了细胞基因组突变的恢复与CRISPR-Cas9的脱靶及细胞污染有关。(4)清除HBV感染后细胞基因组突变恢复的原因分析通过对HBV感染及清除前后细胞基因组SNP类型变化情况的分析结果以及宿主细胞DNA修复通路中RAD51基因表达量的检测结果我们推测,这种杂合SNP的恢复或许是由于存在同源修复模板,进而在DNA修复系统的参与下实现的恢复。本次研究中,我们利用CRISPR-Cas9技术首次实现了对宿主细胞内乙肝病毒感染的清除,深入分析了CRISPR-Cas9在清除HBV过程中的脱靶效应、抑制效率以及作用时间。在清除了HBV感染后的细胞基因组中,我们还观察到了大量HBV的整合位点以及宿主细胞基因组变异会随着HBV的清除而恢复。本次研究展现了CRISPR-Cas9技术在根治慢性乙肝以及阻断其向肝细胞癌发展方面的巨大潜力。此外,清除HBV感染后宿主细胞基因组上的新发现也将为今后进一步研究乙肝病毒与宿主基因组的相互作用以及乙肝病毒致癌机制提供新的线索。