食管癌为最常见的人类恶性肿瘤之一。据相关文献统计结果显示：鳞状上皮细胞癌(ESCC)是我国食管癌发病率最高的病理组织学类型。目前临床治疗食管癌的方法主要是：新辅助化疗、结合术前小剂量放疗以及外科手术切除。据统计,食管癌患者术后5年生存率为25-40%。由于食管癌前期发病隐匿,容易发生转移,通常患者前来就诊时,病情多为中、末期。很多患者丧失了手术的机会。随着外科技术水平的不断发展和放疗、化疗方案的日趋成熟,食管癌的综合治疗达到了一个新的水平,但其手术后5年生存率较以往,并没有显著的提高。食管癌真正的发病机制尚未明确,采取对症治疗原则使得医疗手段十分被动。现代循证医学的发展证明,只有探明食管癌发病的机制,针对相关信号因子的表达加以调控,切断其发病机制中的信号传导通路,才能够最终达到预防食管癌、提高食管癌早期确诊率、延长食管癌患者的生存时间,改善食管癌患者的生存质量。目前的研究报道,肽酰-脯氨酰顺反异构酶Pinl (peptidyl-prolyl cis/trans isomerase Pinl)在许多癌症中高表达,并且还可以作为一些癌症的预后指标,其介导的肽酰-脯氨酰异构化参与肿瘤发生的许多信号通路的调节,与食管癌关系密切的c-Jun、P53、NF-κB、CyclinD1、β-catenin等均为Pin1的作用底物。Pin1也参与许多重要的细胞致癌事件中,比如细胞分化,血管生成以及肿瘤转移等,对Pin1的抑制可以诱导细胞凋亡。同时,一些选择性抑制Pin1的化合物也已经得到了鉴定。这些研究表明,Pin1介导的磷酸化后调节可以提供一种新的破坏原癌通路的机会,同时提供了一条新的抗癌治疗途径。研究报道,Pin1敲除小鼠不仅可以正常发育,而且对转基因引起的致癌性有很高的抵制能力,提示Pin1抑制剂可能具有小的非特异性毒性。本课题系统研究了Pin1在食管鳞癌组织和食管鳞癌细胞株中的表达；通过小干扰RNA技术以及天然药物Juglone的应用,抑制了Pin1的表达并测定了其细胞生物学特性的变化；通过哺乳动物双杂交实验,筛选了与Pin1相互作用的转录因子。实验中得到了一个新的转录因子ATF1。并对其生物学特性进行了初步的研究。本论文的研究为确定Pin1在食管鳞癌发生中的作用及其分子机制提供了理论依据。在食管癌经典化疗药物CDDP使用的基础上联合特异性信号通路阻断的治疗新策略奠定了理论基础。第一章Pin1在食管鳞癌组织和细胞中的表达方法1.收集食管癌根治术中切除的食管癌组织和癌旁组织,通过病理学诊断和分型,针对食管鳞癌组织和癌旁组织进行研究。2.通过免疫组织化学检测食管鳞癌癌周组织与食管鳞癌组织中Pin1的表达,将实验结果进行统计学处理。3.通过细胞化学以及蛋白印迹技术检测经典食管鳞癌细胞株中Pin1的表达。结果从组织学和细胞学角度明确了Pin1在食管鳞癌组织、经典食管癌细胞株中过表达,为进一步研究Pin1在食管鳞癌中的作用奠定了研究基础。第二章稳定干扰Pin1的食管鳞癌细胞系的建立及其对食管鳞癌细胞生物学功能的影响方法1.通过小干扰RNA技术以及药物选择压力的应用,筛选稳定表达针对Pinl小干扰RNA的食管鳞癌细胞系。2.通过流式细胞术以及MTT实验检测稳定基因沉默Pin1后食管鳞癌细胞系生物学特性的变化。3.通过流式细胞术以及MTT实验检测稳定基因沉默Pin1后,食管鳞癌细胞系对经典化疗药物顺铂的敏感性。结果1.筛选到了稳定基因沉默Pin1的食管鳞癌细胞系。2.基因沉默Pin1后食管鳞癌细胞增殖明显受到抑制,食管鳞癌细胞凋亡发生率显著提高。3.干扰食管鳞癌EC1细胞Pin1的表达后,可以增加对其对临床常用化疗药物顺铂的敏感性。基因沉默Pin1可以提高顺铂抑制食管鳞癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的能力,二者抑制食管鳞癌细胞增殖、诱导食管鳞癌细胞凋亡的效应叠加,理论上可以提高顺铂抗肿瘤的疗效。第三章Pin1抑制剂Juglone对食管鳞癌细胞EC1生物学特征的影响方法体外培养人食管鳞癌细胞系EC1,使用植物提取的天然Pin1抑制剂Juglone对细胞进行处理。MTT试验检测细胞生长增殖状况,流式细胞仪检测细胞周期以及细胞凋亡结果MTT试验表明,Juglone对EC1细胞生长有明显的抑制作用,且抑制作用随着作用浓度和作用时间的提高呈明显上升。流式细胞仪检测结果表明,加入Juglone培养48 h后,EC1细胞出现G2＼M期阻滞。Juglone培养48 h后,EC1细胞的凋亡率随着作用浓度的升高而显著提升。第四章食管鳞癌中与Pin1相互作用的转录因子ATF1及其功能研究方法1.哺乳动物双杂交实验筛选与Pin1相互作用的转录因子。2. GST pull down实验进一步验证Pin1与目的因子的相互作用。3.流式细胞仪检测该目的因子对于细胞增殖的作用。结果筛选到了一个新的,与Pin1相互作用的转录因子ATF1。对其在细胞增殖方面的作用进行研究,发现ATF1过表达可以造成食管鳞癌细胞S期阻滞。1.Pin1在食管鳞癌组织、食管鳞癌细胞株EC1、EC9706中过表达。2.筛选并建立稳定基因沉默Pin1的食管鳞癌细胞系,为后期研究Pin1的功能奠定基础。3.使用小干扰RNA技术和＼或植物提取物Juglone抑制Pin1基因表达,可明显抑制食管鳞癌细胞增殖；提高食管鳞癌细胞凋亡率；下调食管鳞癌EC1细胞中Pin1的表达后,可以提高食管鳞癌细胞对化疗药物顺铂的敏感性。基因沉默Pin1可以提高顺铂抑制食管鳞癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡的能力。在上述实验的基础上可以推测：通过分子生物学手段下调食管鳞癌细胞中Pin1的表达水平同时使用Pin1的天然植物体抑制剂Juglone,二者抑制食管癌细胞增殖、诱导食管癌细胞凋亡的效应叠加,理论上能显著提高抗食管癌的疗效。有望在传统治疗手段的基础上,提供了联合特异性信号通路阻断的食管鳞癌治疗研究新思路。4.筛选到了食管鳞癌中与Pin1相互作用的新的转录因子ATF1,发现ATF1过表达,可以造成食管鳞癌细胞S期阻滞。将研究Pin1在食管鳞癌发病通路中的作用机制推向深入,为最终揭示食管鳞癌发病机制奠定研究基础。