近年来,基因编辑技术已经得到了迅速的发展。与传统的基因克隆技术不同,通过基因编辑技术,人们可以对基因进行敲除、插入、定点突变等修饰操作,从而实现基因功能与调控元件的研究。基因编辑技术在基因制药、基因诊断、基因治疗等技术方面已经取得的巨大的成果,将极大地改变人类生命和生活的面貌。CRISPR/Cas9技术(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9)作为第三代人工核酸内切酶技术,是一种具有广阔前景的基因修饰工具。在细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制的CRISPR/Cas系统,可用来对抗病毒及外源DNA的入侵。其衍生的CRISPR/Cas9技术相对于之前的锌指核酸内切酶(Zinc-finger nucleases,ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,Talens)技术来说,该技术具有成本低、毒性小、适用范围广、操作周期短等优点,为基因组定向改造、调控与应用等带来突破性革命。目前,CRISPR/Cas9技术已经在许多模式动物基因敲除方面的研究上获得成功案例,其方法大部分都是利用注射直接获得模式动物或者利用筛选标记基因来获得目的细胞,但是采用CRISPR/Cas9技术敲除牛基因获得不含有筛选标记的细胞实验还很少。肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)又称GDF-8,属于TGF-β超家族,能够通过调控成肌细胞的大小、数量和增殖速度来实现负向调控节肌肉的生长。哺乳动物MSTN基因缺失或失活会出现肌纤维直径变大或肌纤维数增加,导致肌肉过度发育的现象。自然诱变或者基因编辑都可以使MSTN基因反生功能性障碍,使动物出现“双肌”的性状。MSTN基因的研究对动物产肉量具有很大的意义,已经得到了广泛的研究。所以,通过基因编辑技术来获得“双肌”性状的肉牛具有很重要的生产价值和广阔的应用价值。本研究利用CRISPR/Cas9系统的不同类型的表达载体对牛MSTN基因外显子区域序列随机设计靶位点。靶位点活性的好坏,没有采用传统的SSA活性检测法,而是在无筛选标记条件下利用T7核酸内切酶I(T7EI)从设计的靶位点和载体中挑选出敲除效率最高的靶位点的表达载体。之后对鲁西黄牛(LXHN)胎儿成纤维细胞进行基因敲除实验,通过有限稀释法制备单细胞克隆,利用PCR测序和T7EI的方法来鉴定细胞克隆,获得MSTN基因敲除的细胞株,为转基因动物的制备提供材料。同时简单检测了在敲除试验中双靶点对突变效率的影响。主要研究结果如下:1.CRISPR/Cas9打靶载体的构建以牛MSTN基因第二外显子为靶位点的ps Pg RNA-M-A、p X330-M-A;以MSTN基因第三外显子为靶位点的ps Pg RNA-M-B、p X330-M-B、ps Pg RNA-M-X、ps Pg RNA-M-Y。2.CRISPR/Cas9打靶载体突变效率的检测采用T7EI酶切法检测不同靶位点的突变效率,最高突变效率为36.67%3.有限稀释法制备单细胞克隆和MSTN基因突变细胞株的筛选。采用有限稀释法共获得的53个细胞克隆。其中5个MSTN基因敲除克隆(MSTN-/-)。4.双靶点法突变效率检测试验第三外显子3个靶位点两两组合的突变效率的高低,证明双靶点突变效率与靶点间的距离有关。