急性心肌梗死患者血运重建治疗的广泛开展,极大地减少了心肌梗死面积,改善了患者预后。但随着心肌组织血流灌注的恢复,心肌发生缺血-再灌注损伤（Myocardial Ischemia Reperfusion injury,MIRI）,使心肌损伤加重,引发心肌细胞凋亡、心肌顿抑等不良事件,导致院内心梗患者血运重建后仍有心力衰竭发生、心脏骤停的风险。以往对MIRI的机制和评价得到广泛的重视和研究,但都局限在组织病理学、心肌损伤标志物和氧化应激等方面,而非编码RNAs作为疾病病理生理过程的分子标记、治疗靶点具有巨大的潜力。为此,我们从非编码RNAs的角度探究心肌缺血再灌注损伤的转录后调控机制,以期更早地预警缺血再灌注损伤,并成为治疗靶点,减轻缺血再灌注损伤,改善心肌梗死后血运重建患者的临床结局。本研究在动物水平构建心肌缺血-再灌注损伤模型,通过对心肌缺血再灌注损伤不同时间的组织进行测序及分析,得出随再灌注损伤过程时间变化的非编码RNAs调控分子。之后,利用实时荧光定量PCR（Quantitative Real Time PCR,q PCR）及蛋白印记检测（Western blot,WB）检测的方法,在MIRI心肌组织及缺氧/复氧（Hypoxia/Reoxygenation,H/R）诱导的细胞凋亡模型上,对测序结果中最显著变化的11个分子进行验证实验。验证后,利用基因干涉技术,对随时间变化显著的分子LncRNA MAPKAPK5-AS1、mi R-124-3p的功能进行探索。第一部分 缺血后不同再灌注时序大鼠心肌组织转录组学测序研究目的:在动物水平构建MIRI模型,通过对MIRI不同时间的组织进行测序及分析,明确随再灌注时间变化的非编码RNAs调控分子。方法:应用结扎大鼠冠状动脉前降支方法构建大鼠的MIRI模型,结扎时间为30分钟,随后解开结扎线使心肌重新获得血流,进行再灌注损伤模型构建,分别在再灌注30分钟、60分钟、120分钟时处死大鼠,腹主动脉采血,开胸取心肌组织,提取心肌组织RNA及蛋白质,应用苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin Stain,HE）染色、免疫组化染色观察组织学形态,应用酶联免疫检测法（Elisa）对血清心肌损伤标志物进行模型的评价。提取的RNA经过质控后,各组选取3个心肌,使用高通量测序技术对心肌组织进行测序,分析各时间节点差异表达的m RNA、LncRNA、mi RNA情况,利用GO及KEGG通路富集分析,预测各种非编码RNA及m RNA之间的靶标关系,并根据时序趋势找寻随着MIRI程度变化显著的分子,利用生物信息学预测MIRI随时间变化的转录后调控机制。结果:1、在MIRI早期（再灌注30分钟）,差异表达的m RNA有177个、LncRNA11个、mi RNA 2个,这些RNAs的差异表达主要集中在炎症、氧化应激等病理生理过程。2、在MIRI晚期（再灌注120分钟）,差异表达m RNA 143个、LncRNA 330个、mi RNA 115个,这些RNAs的差异表达集中在细胞凋亡、细胞周期调控等病理生理过程。3、在MIRI全程,有11个调控分子随再灌注时间变化差异显著,分别是LOC10369223、Lnc MAPKAPK5-AS1、LOC102553854、LOC103690547、mi R-124-3p、mi R-21、mi R-615、mi R-125-5p、E2F3、PTEN、PI3K。第二部分 qPCR及WB鉴定心肌缺血后随再灌注时间变化的分子表达水平目的:由于测序结果是基于各组的3个大鼠心肌所得,为了验证测序结果及避免系统误差,我们利用q PCR及WB检测的方法,在动物及细胞模型上对第一部分实验中测序所得的11个调控分子进行验证。方法:动物水平验证使用的是第一部分非测序的大鼠心肌组织。细胞水平验证使用H/R法构建的H9C2心肌细胞凋亡模型。提取组织及细胞内的RNA及蛋白质,利用PCR及WB检测在动物水平及细胞水平对测序结果中最显著变化的11个分子进行验证实验。结果:1、细胞H/R模型及MIRI心肌组织的q PCR及WB结果显示,随时间变化最显著的11个调控分子的定量分析与高通量测序结果一致;2、在MIRI过程中,mi R-124-3p和LOC103690547随再灌注时间进展表达水平逐渐下降,mi R-615、LncRNA MAPKAPK5-AS1随再灌注时间进展表达水平逐渐升高,提示其可能参与MIRI发生发展的全过程。第三部 下调LncRNA MAPKAPK5-AS1通过作用于mi R-124-3p及E2F3从而改善H/R诱导的心肌细胞凋亡的机制探索目的:验证测序结果后,通过生物信息学分析和机制推测LncRNA MAPKAPK5、mi R-124-3p及E2F3可能存在调控关系。通过改变H9C2心肌细胞内LncRNA MAPKAPK5-AS1的水平,检测心肌细胞凋亡情况,明确下游分子mi R-124-3p及E2F3变化情况,验证是否能通过下调LncRNA MAPKAPK5-AS1从而改善H/R诱导的心肌细胞凋亡的机制探索。方法:使用质粒载体及干扰RNA改变和H9C2心肌细胞LncRNA MAPKAPK5-AS1表达量后,再构建H/R模型,利用q PCR及WB检测细胞凋亡标志物化及mi R-124-3p及E2F3的表达变化。使用双荧光色素酶报告系统明确LncRNA MAPKAPK5-AS1、mi R-124-3p及E2F3的靶标关系,从而推测出下调LncRNA MAPKAPK5-AS1在改善H/R诱导的心肌细胞凋亡作用的机制。结果:1.在细胞过表达LncRNA MAPKAPK5后,抗凋亡蛋白表达下降、促凋亡蛋白表达增加,说明LncRNA MAPKAPK5的过表达会加重缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡;2.在细胞过表达LncRNA MAPKAPK5后,mi R-124-3p表达下降,E2F3表达增加,在细胞沉默LncRNA MAPKAPK5后,mi R-124-3p表达上升,E2F3表达减少。同时沉默LncRNA MAPKAPK5及mi R-124-3p后E2F3表达恢复至正常水平,说明三者存在一定的调控关系;3.双荧光色素酶报告系统证实LncRNA MAPKAPK5/mi R-124-3p/E2F3的靶标关系。结论:1.不同基因在缺血再灌注损伤过程中表达发挥的时序不同,mi R-124-3p、LOC103690547在MIRI全程持续低表达、mi R-615、LncRNA MAPKAPK5在MIRI全程持续高表达,有望成为心肌缺血再灌注损伤时序敏感的分子标记物;2、通过下调LncRNA MAPKAPK5的表达能改善心肌缺氧/复氧后的心肌凋亡,可能成为改善MIRI的治疗靶点;3、下调LncRNA MAPKAPK5的表达后,能上调mi R-124-3p,下调E2F3的表达,从而减轻H/R诱导的心肌凋亡。