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多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma, MM)是起源于B细胞系的血液系统恶性肿瘤,以骨髓内单克隆浆细胞异常增生为特征。MM患者常有骨痛、贫血、肾功能不全以及反复感染等临床表征,并产生溶骨性骨重吸收和骨生成障碍、骨髓瘤骨病等并发症。尽管自体或异体造血干细胞移植治疗MM已取得显著疗效,但仍未能达到根治效果。究其原因是肿瘤组织中存在一小部分肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs),具有无限增殖、自我更新、高致瘤以及耐受放化疗能力。因此,靶向CSCs可能是特异性有效治疗MM的手段之一。微小RNA (microRNA, miRNA)是一类在多种真核生物和病毒中产生的内源性非编码单链RNA,在细胞增殖、代谢、凋亡、衰老、分化等过程中发挥重要作用。研究证实,miRNA与肿瘤关系密切,以癌基因、抑癌基因或信号传导分子等多种角色参与调控肿瘤的生物学过程；而miRNA在多种CSCs中异常表达,参与维持众多CSCs的恶性表型。MiRNA-34a作为miRNA-34家族成员之一,因具有引起肿瘤细胞G1期阻滞和凋亡的功能,被认为是潜在的肿瘤生长抑制因子。文献报道显示,miR-34a在胰腺癌、肾癌、胶质母细胞瘤等多种肿瘤组织中异常表达。然而,miR-34a几何在MM及其CSCs中发挥作用却罕见报道。基于以上研究背景,本研究选择人MM细胞系RPMI8226作为研究对象,构建表达miR-34a的重组载体,利用普鲁兰精胺脂多糖纳米材料(Pullulan-spermine (Ps) lipopolysaccharide- nanoparticle)将其转染进入细胞内并筛选得到稳定转染细胞株,以完成miR-34a的过表达;通过体内外实验和双荧光报告质粒分析,探讨并验证上调CSCs中miR-34a可否作为治疗MM的新手段。目的：探讨过表达miR-34a对人MM细胞及其CSCs的生物学特性影响,为靶向调控CSCs有效治疗MM提供实验依据。方法与内容：1.构建含有miR-34a的重组质粒及稳定转染RPMI8226细胞克隆的筛选：RT-PCR鉴定人MM细胞系RPMI8226中IniR-34a的表达；构建并鉴定pIRES-miR-34a重组载体。利用Ps材料将该重组载体转染进入RPMI8226细胞中,经G418筛选得到稳定表达miR-34a的细胞株,即ST (Stably transfected)-RPMI8226细胞。2.探究miR-34a对MM RPMI8226细胞及其CSCs的影响：通过CCK8、软琼脂克隆形成、流式细胞术等实验检测ST和WT (Wild type)-RPMI8226细胞的增殖活性、体外克隆形成能力和抗凋亡能力。采用免疫磁珠分离技术,依据细胞表面分子标记,分别从MM ST-RPMI8226和WT-RPMI8226细胞系中筛选出表型为CD138-CD34-的CSCs,分别将ST和WT-RPMI8226细胞以及ST和WT-RPMI8226 CSCs经皮下注射至非肥胖糖尿病／严重的联合型免疫缺陷(nonobese diabetic/severecombined immunodeficient, NOD/SCID)小鼠,观察不同实验组小鼠成瘤时间、生存期和肿瘤体积,通过骨骼CT扫描监测骨密度改变,并应用苏木精和伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色法从病理改变分析凋亡效应,以探讨过表达miR-34a对MM RPMI8226及其CSCs在NOD/SCID鼠体内致瘤能力的影响。3. MiR-34a通过抑制转化生长相互作用因子2(Transforming growth interaction factor 2, TGI F2)的表达维持骨稳态：利用生物信息学手段预测miR-34a的下游靶点TGIF2,并用双荧光报告系统验证。QPCR检测转染miR-34a mimics的RPMI8226细胞中miR-34a和TGIF2 mRNA的表达水平,以及动物实验所获肿瘤组织中miR-34a和TGIF2 mRNA的表达水平；Western blot检测各组种瘤组织中TGIF2蛋白表达水平。结果：1. RT-PCR检测证实在人MM细胞系RPMI8226中存在miR-34 a的低表达；成功构建并鉴定miR-34a的重组载体pIRES-miR-34a。将构建的真核重组表达载体通过Ps材料转染至RPMI8226细胞48h后,细胞中miR-34a的含量显著增加；经G418成功筛选并鉴定出稳定表达niR-34a的细胞株ST-RPMI8226,差异均有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。2.体外实验结果显示,相对于WT-RPMI8226细胞,ST-RPMI8226细胞的增殖能力受到抑制、克隆形成能力减弱,凋亡率增加；体内实验结果显示,WT-RPMI8226田胞和WT-RPMI8226 CSCs在致瘤能力和肿瘤大小等方面强于ST-RPM18226细胞和ST-RPMI8226 CSCs,骨扫描和H&E染色结果均得到一致结果,差异均有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。3.生物信息学预测及双荧光报告系统结果显示,TGIF2是miR-34a的调节靶点。QPCR结果显示,转染了miR-34a mimics的RPMI8226细胞niR-34a的表达量显著增高而TGIF2含量有所降低；对NOD/SCID小鼠肿瘤组织进行的检测结果也显示了相同的结果,差异均有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。结论：1.过表达miR-34a可在一定程度上降低人MM细胞系RPMI8226在体外的克隆形成能力、增殖能力及体内致瘤能力,同时增加肿瘤细胞的凋亡率,从而抑制MM的生长。2.过表达niR-34a可减弱MM CD138-CD34-CSCs的致瘤性,减低TGIF2表达及骨损伤,提示miR-34a或其调控的下游分子TGIF2可作为MM治疗的新靶点。