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研究背景:新生儿窒息致缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage ,HIBD)是新生儿期常见的临床疾病,已成为导致儿童脑瘫、严重危害新生儿健康成长的重要原因。2003年我国进行第二次多中心治疗观察重度HIBD的预后,发现预后不良率仍高达20.8%,因此目前的治疗手段对中重度HIBD的疗效仍然很有限。近年对干细胞的研究表明,新生动物脑内存在神经干细胞(neural stem cells ,NSC),在HIBD后,内源性NSC可反应性增殖、分化以促进脑结构及功能的改善。但内源性NSC反应性增殖、分化的力度很有限,其分化率较低。Liu等采用5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记技术追踪观察HIBD后海马齿状回新生NSC分化为神经元的情况,发现在HIBD后15天,未见NSC分化为成熟神经元,在26天后也仅有27%的BrdU阳性细胞分化为成熟神经元。Masanori等追踪观察HIBD后沙鼠室管膜下区及颗粒层NSC增殖及分化情况,表明在HIBD后10天室管膜下区NSC增加了3倍,追踪观察到60天也仅有少数细胞分化为表达神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein ,GFAP,成熟星型胶质细胞表面标志)的星型胶质细胞和表达神经元特异性核抗原(neuron-specific nuclear antigen,NeuN,成熟神经元表面标志)的神经元。因此,如何提高内源性神经干细胞在脑内的增殖和神经性分化效率,真正发挥干细胞的替代修复作用值得深入研究。近年来研究表明,干细胞在脑内的分化受局部微环境影响。因此,在HIBD后的病态微环境中是否存在某种因素抑制了内源性神经干细胞再生和神经性分化,从而导致内源性NSC的分化率较低,难以有效的重建大脑结构及功能值得深入研究。如能找到这一抑制性因素并采取针对性治疗措施,将有望全面改善HIBD预后。Foxg1基因是FOX基因家族的一个重要成员,研究表明胚胎大脑发育过程中干细胞的增殖、分化受到关键基因Foxg1的调控,该基因的表达缺陷将导致干细胞发育分化障碍,进一步导致大脑结构发育缺陷,且正常出生后Foxg1仍然持续表达于由端脑分化来的脑组织(大脑皮质、海马、嗅球及基底核等)中,而发生HIBD时正是这些脑组织容易受到损伤。新生动物HIBD后脑结构与功能重建是胚胎期发育的再现和延续,因而Foxg1基因可能在HIBD后干细胞分化增殖的过程中扮演一重要角色因素。目的:观测HIBD后Foxg1基因和脑皮质各层特定基因(Foxp2, ER81, Otx1, Foxp1, ROR?)表达的动态变化分析两者的相关性,初步探讨是否存在HIBD后Foxg1基因水平的下降导致大脑皮质自身修复受限,表现为各层结构特定基因表达下调;观测卡哈尔—雷济厄斯细胞(Cajal-Retzius cells,CR细胞)在发生HIBD后的变化情况,初步探讨是否存在内源性NSC向CR细胞分化增多,而向其它皮质层的成熟神经细胞分化减少的现象。方法:采用Rice法制作新生鼠HIBD动物模型,假手术组作为对照组,分别在术后第3、7、14、28、56天取右侧脑半球。半定量RT-PCR检测标本中各个基因的表达,免疫组化检测标本CR细胞数目变化。结果:1模型鉴定:常规HE染色检查结果显示结扎侧出现明显的病理变化,病变在大脑皮层和海马尤为明显,主要为神经元坏死,表现为空泡、核固缩、组织结构模糊及炎症细胞增多等。2半定量RT-PCR结果:(1)Foxg1基因:Foxg1基因的表达在术后第3、7、14、28、56天的结果分别为0.524±0.086,0.726±0.067,0.770±0.122 , 0.786±0.083 , 0.882±0.081 ;对照组的结果分别为0.798±0.121,0.787±0.078,0.664±0.109,0.744±0.096,0.757±0.065。两组比较在第3天和第56天有显著性差异。总体上模型组Foxg1基因的表达在早期出现明显下调随着时间的推移呈现出上升趋势而对照组Foxg1基因表达相对较稳定。(2)Reelin基因:Reelin基因的表达在术后第3、7、14、28、56天的结果分别为0.591±0.034,0.542±0.131,0.533±0.085 , 0.694±0.063 , 0.668±0.144 ;对照组的结果分别为0.565±0.113,0.329±0.062,0.474±0.081,0.553±0.073,0.618±0.104。两者比较在第7天和第28天有显著性差异。总体上模型组Reelin基因的表达量在各个时间点均高于对照组。(3)Foxp1基因:Foxp1基因的表达在术后第3、7、14、28、56天的结果分别为0.616±0.056,0.886±0.096,0.710±0.059,0.636±0.070,0.698±0.109;对照组的结果分别为0.737±0.115 , 0.743±0.102 , 0.746±0.108 , 0.735±0.082 ,0.899±0.064。两者比较在第3、7、28和56天有显著性差异。总体上模型组Foxp1基因的表达水平是低于对照术组。(4)ER81基因:ER81基因的表达在术后第3、7、14、28、56天的结果分别为0.654±0.096,0.942±0.068,0.724±0.094,0.838±0.105,0.977±0.123;对照组的结果分别为0.710±0.120 , 0.666±0.139 , 0.797±0.107 , 0.941±0.141 ,1.027±0.113。两者比较在第7天有显著性差异。总体上模型组基因的表达水平低于对照组。(5)Otx-1基因:术后第3天模型组Otx-1基因的表达未能检测出而对照组正常测出。从术后第7天开始模型组和对照组均能够检测出,且在第7天后模型组Otx-1的表达水平高于对照组。模型组的表达在术后第3、7、14、28、56天的结果分别为0.000±0.000,0.713±0.122,0.570±0.134,0.535±0.037,0.551±0.044;对照组的结果分别为0.571±0.098 , 0.466±0.137 , 0.463±0.133 , 0.462±0.121 ,0.401±0.061。两者比较在第7天和第56天有显著性差异。(6)RORβ基因:RORβ基因的表达在术后第3、7、14、28、56天的结果分别为00.951±0.118,0.839±0.078,0.786±0.114,0.828±0.109,1.120±0.204;对照组的结果分别为0.984±0.133,0.868±0.169,1.060±0.225,1.238±0.155,0.854±0.094。两者比较在第14、28和56天有显著性差异。总体上在发生HIBD后的前期RORβ基因的表达是降低的。(7)Foxp2基因:Foxp2基因的表达在术后第3、7、14、28、56天的结果分别为0.460±0.107 , 0.526±0.119 , 0.566±0.164 , 0.455±0.050 ,0.570±0.061 ;对照组的结果分别为0.543±0.104 , 0.420±0.163 ,0.452±0.055,0.469±0.043,0.422±0.055。两者比较在第14天和第56天有显著性差异。总体上在发生HIBD后的前期Foxp2基因的表达是降低的。3免疫组织化学结果:在进行免疫组化染色之后结果显示模型组随着时间的推移Reelin抗原阳性细胞(主要为CR细胞)增生明显,而对照组细胞数目变化不大。镜下显示增生的阳性细胞分布不均且有团状聚集倾向。模型组在第3、7、14、28、56天的阳性细胞数分别为24.9±2.424,31.4±4.452,42.3±2.908,47.1±1.853,45.5±2.173个;对照组阳性细胞数分别为21.7±2.627,21.7±3.199,21.8±3.190,22.4±2.221,27±2.000个。两者在各个时间点比较,差异均有显著性意义(P <0.05 )。4统计学结果正常情况下即对照组中Otx1基因与Foxg1基因的表达呈正相关而模型组Otx1基因与Foxg1基因的表达却变成了负相关,Reelin基因与Foxg1基因的表达在对照组中呈现负相关而模型组中却变成了正相关,Foxp1、ER81、RORβ、Foxp2基因与Foxg1基因的关系在对照组和模型组中均呈现出负相关性。结论: HIBD后新生鼠脑组织中Foxg1基因表达下调,皮质特定基因Reelin基因表达上调,Foxp2, ER81, Otx1, Foxp1和ROR?基因表达下调。由于HIBD后早期脑组织Foxg1基因的表达下调导致内源性NSC向CR细胞分化增加而向各层脑皮质的成熟神经元分化减少,导致HIBD早期脑组织自身修复困难。发生HIBD后Foxg1基因的表达与Reelin,Otx-1基因的表达关系密切,Reelin基因的表达与Foxg1基因呈正相关,Otx-1基因的表达与Foxg1基因呈负相关。Foxg1基因与Foxp1,ER81,RORβ,Foxp2基因表达的关系不明显。Foxg1基因是否作为脑皮质特定基因的上游基因直接控制这些基因的表达有待进一步的研究。