论文部分内容阅读
羊肚菌(Morchella esculenta(L.)Pers.)是一种珍稀食用菌,主要有黑脉羊肚菌(Morchella angusticeps Peck)、肋脉羊肚菌(Morchella costata Pers.)、尖顶羊肚菌(Morchella conica Pers.)、粗柄羊肚菌(Morchella crassipes(Vent.)Pers.)等20多个品种。羊肚菌富含蛋白、酚酸、多糖等营养活性成分,具有增强机体免疫力、抗氧化、抗疲劳、抗病毒、抑制肿瘤等作用。许多研究证实,天然多糖经过化学修饰后通过引入新的化学基团可以明显提升多糖的生物活性,甚至产生新的活性,已成为糖生物化学及营养学的研究热点。本论文以黑脉羊肚菌(Morchella angusticeps Peck)为原料制备羊肚菌多糖(PMEP),对其进行硫酸化、羧甲基化、乙酰化等化学修饰,并比较修饰前后羊肚菌多糖抗氧化、抗增殖及免疫调节活性变化,探讨其作用机制。以期为黑脉羊肚菌多糖的开发利用提供理论依据。主要研究内容和结果如下:(1)采用氯磺酸-吡啶法、一氯乙酸法和乙酸酐法对羊肚菌多糖进行硫酸化、羧甲基化及乙酰化修饰,并对修饰多糖进行结构表征。结果表明:修饰试剂的比例(使用量)越高,取代度也越高,但过高的取代度会导致多糖糖含量或得率降低。紫外光谱分析显示,羊肚菌多糖经化学修饰后,并未出现新的吸收峰;红外光谱分析显示,三种修饰多糖除保持原有的多糖特征吸收峰外,还具有修饰基团特征吸收峰。说明羊肚菌多糖修饰成功,且多糖结构没有发生较大程度的改变。(2)研究化学修饰羊肚菌多糖对HepG2、Caco-2细胞的增殖抑制活性。结果表明:羊肚菌多糖对HepG2、Caco-2细胞增殖均有明显的抑制作用,并呈现良好的剂量效应关系,抗增殖能力EC50分别为0.754 mg/mL和1.84 mg/mL。羊肚菌多糖经硫酸化和羧甲基化修饰后对HepG2细胞和Caco-2细胞增殖均没有抑制作用;而经乙酰化修饰后,Ac-PMEP1、Ac-PMEP2和Ac-PMEP3对HepG2、Caco-2细胞增殖均具有明显的抑制作用,并呈现良好的剂量效应关系,Ac-PMEP3抑制HepG2、Caco-2细胞增殖能力显著强于羊肚菌多糖(P<0.05),其EC50分别为0.71 mg/mL和1.229 mg/mL。说明羊肚菌多糖的化学修饰方法和取代度不同,其抗细胞增殖活性也不同。(3)通过ABTS自由基清除率和氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)实验对化学修饰前后羊肚菌多糖的体外化学抗氧化活性进行评价;以HepG-2细胞模型,对化学修饰前后羊肚菌多糖的细胞抗氧化活性(cellular antioxidant activity,CAA)进行测定。结果表明:羊肚菌多糖对ABTS自由基清除的EC50值为0.697 mg/mL,ORAC值为372.04μmol TE/g,表明羊肚菌多糖具有良好的化学抗氧化活性。羊肚菌多糖CAA值为3.08μmol QE/g(No PBS wash)、1.96μmol QE/g(PBS wash),表明羊肚菌多糖在细胞膜外有一定的抗氧化活性,但细胞膜内的抗氧化效果较差。与羊肚菌多糖相比,硫酸化和羧甲基化修饰后的羊肚菌多糖抗氧化活性均显著降低;乙酰化修饰后的羊肚菌多糖(Ac-PMEP1、Ac-PMEP2、Ac-PMEP3)ABTS自由基清除率、ORAC值、CAA值均显著增强(P<0.05),说明羊肚菌多糖经过乙酰化修饰后可明显提高其化学抗氧化活性和细胞抗氧化活性,并且与多糖乙酰基取代度的大小呈正相关。(4)以小鼠巨噬细胞RAW264.7为模型,研究了化学修饰对羊肚菌多糖免疫调节活性的影响。结果表明:当RAW264.7细胞处于静息状态时,羊肚菌多糖化学修饰前后均能在一定程度上促进细胞增殖,增强细胞吞噬活性,提高NO和TNF-α的释放量(免疫上调作用);与羊肚菌多糖相比,在一定浓度范围内,硫酸化修饰多糖(S-PMEP1:12)、羧甲基化修饰多糖(CM-PMEP1)和乙酰化修饰多糖(Ac-PMEP1、Ac-PMEP2、Ac-PMEP3)均能显著促进RAW264.7细胞增殖、提高细胞吞噬活性(P<0.05),其中Ac-PMEP3处理还能显著提高NO和TNF-α的释放量(P<0.05)。当RAW264.7处于LPS过度诱导状态时,羊肚菌多糖及硫酸化、乙酰化修饰多糖均能在一定程度上下调细胞吞噬活性,降低NO和TNF-α的释放量(免疫下调作用);与羊肚菌多糖相比,硫酸化修饰多糖(S-PMEP1:3、S-PMEP1:12)和乙酰化修饰多糖(Ac-PMEP1、Ac-PMEP3)均能明显下调过度激活的RAW264.7(P<0.05),其中Ac-PMEP3作用效果最好。(5)以小鼠巨噬细胞RAW264.7为模型,对羊肚菌多糖及乙酰化修饰多糖免疫调节活性机制进行研究。结果表明:当RAW264.7细胞处于LPS静息状态时羊肚菌多糖高剂量组(PMEP-H,50μg/mL)和乙酰化多糖高剂量组(Ac-PMEP-H,50μg/mL)均能显著升高核转录因子-kappa B(NF-κB)二聚体中p65(核)、可诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和磷酸化p38蛋白激酶(p-p38)的含量,并显著降低NF-κB的抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB-α)的含量(P<0.05)。当RAW264.7处于LPS过度诱导状态时,PMEP-H和Ac-PMEP-H均能显著抑制p65(核)、iNOS和p-p38含量的升高,并显著抑制IκB-α含量的降低(P<0.05)。说明羊肚菌多糖对巨噬细胞RAW264.7的调控机制可能是通过NF-κB和p38/MAPK通路来调控相关细胞因子的表达。与羊肚菌多糖相比,乙酰化修饰多糖(Ac-PMEP3)对RAW264.7的免疫下调作用更加突出。