论文部分内容阅读
牛疱疹病毒5型(Bovine herpesvirus 5，BoHV-5)是疱疹病毒科α疱疹病毒亚科水痘病毒属的一员，感染犊牛后引起严重神经系统疾病，造成巨大的经济损失。BoHV-5感染首先在口腔或生殖器粘膜产生裂解感染以进行病毒复制；随后沿嗅觉和三叉神经途径逆行到感觉神经元，在此建立以潜伏期相关转录为特征的潜伏期；受到应激刺激后再激活，产生感染性病毒粒子。
α疱疹病毒有两个典型特征：在神经细胞中建立潜伏感染和编码miRNAs。MiRNA体积小，功能灵活且不易产生免疫原性，作为新兴的调控因子，对调节病毒或宿主基因表达等方面具有重要功能。本实验室前期通过高通量测序和NorthernBlot技术验证了BoHV-5感染牛肾细胞(Madin-Darby bovinekidney,MDBK)后，其基因组编码至少11个miRNAs基因，BoHV-5-miR-B1至BoHV-5-miR-B11，这些基因的前体miRNA(pre-miRNA)被加工成16种成熟的miRNAs。然而，在裂解性感染过程中表达的BoHV-5miRNAs对病毒潜伏期的建立和再激活的作用尚待阐明。由于动物模型成本较高且耗时长，目前缺乏能够研究与BoHV-5再激活相关的关键分子的稳健实验模型，病毒miRNAs在潜伏期的表达检测受到阻碍，对病毒在裂解感染和潜伏感染之间转换的潜在分子机制了解甚少。为了研究牛疱疹病毒miRNA在不同感染转换之间发挥的作用，我们进行以下的研究，具体内容如下：
1建立BoHV-5体外潜伏感染再激活模型
首先在体外分离培养了昆明鼠颈上神经节(superior cervical ganglion，SCG)细胞，验证SCG支持BoHV-5有效感染。在100μmACV和125IU/mLIFN-α存在下BoHV-5感染SCG后表现出潜伏期的关键标志，包括潜伏相关基因(Latency-related， LR)积累、可检测的裂解基因表达的缺失和潜伏期病毒基因组的存在，以及神经生长因子(nerve growth factor，NGF)去除后感染性病毒粒子的产生。
2BoHV-5体外感染中miRNA的表达
在构建的BoHV-5体外潜伏感染再激活模型基础上，通过茎环引物反转录PCR(stem-loop RT-PCR)检测裂解感染、潜伏感染和再激活三种情况下BoHV-5编码的16种miRNAs的表达时序，并通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization， FISH)技术鉴定了miR-10-3p和miR-10-5p的存在。我们的结果表明BoHV-5在裂解感染和潜伏状态microRNAs的差异表达。
3miRNA-B10-3p在BoHV-5体外感染中的作用研究
最终将在裂解感染时读数最高并在潜伏期可检测到的miR-10-3p作为后续研究病毒miRNA在BoHV-5生命周期中作用的代表角色。我们使用细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome，BAC)重组方案将miRNA-B10-3p的靶位点UL39的3UTR产生7个碱基突变。结合实验室前期构建的miRNA-B10-3p致弱毒株，与野生型相比，突变株失去对靶基因调控表现为裂解感染期高拷贝DNA的复制，导致需要提高抗病毒药物使用量才能在体外建立潜伏期，潜伏期基因组表现出比野生型更强的活跃度和高效率的再激活。
总之，我们的试验结果表明，BoHV-5潜伏期的研究将从体外神经元培养模型中获益，并证明BoHV-5体外潜伏感染再激活模型有助于研究不同感染时期中miRNAs的表达。MiRNA-B10-3p对BoHV-5潜伏和再激活的影响揭示了独立于宿主对病毒基因组的沉默之外，病毒自身miRNA可以作为病毒在不同感染状态之间转换的开关之一。
α疱疹病毒有两个典型特征：在神经细胞中建立潜伏感染和编码miRNAs。MiRNA体积小，功能灵活且不易产生免疫原性，作为新兴的调控因子，对调节病毒或宿主基因表达等方面具有重要功能。本实验室前期通过高通量测序和NorthernBlot技术验证了BoHV-5感染牛肾细胞(Madin-Darby bovinekidney,MDBK)后，其基因组编码至少11个miRNAs基因，BoHV-5-miR-B1至BoHV-5-miR-B11，这些基因的前体miRNA(pre-miRNA)被加工成16种成熟的miRNAs。然而，在裂解性感染过程中表达的BoHV-5miRNAs对病毒潜伏期的建立和再激活的作用尚待阐明。由于动物模型成本较高且耗时长，目前缺乏能够研究与BoHV-5再激活相关的关键分子的稳健实验模型，病毒miRNAs在潜伏期的表达检测受到阻碍，对病毒在裂解感染和潜伏感染之间转换的潜在分子机制了解甚少。为了研究牛疱疹病毒miRNA在不同感染转换之间发挥的作用，我们进行以下的研究，具体内容如下：
1建立BoHV-5体外潜伏感染再激活模型
首先在体外分离培养了昆明鼠颈上神经节(superior cervical ganglion，SCG)细胞，验证SCG支持BoHV-5有效感染。在100μmACV和125IU/mLIFN-α存在下BoHV-5感染SCG后表现出潜伏期的关键标志，包括潜伏相关基因(Latency-related， LR)积累、可检测的裂解基因表达的缺失和潜伏期病毒基因组的存在，以及神经生长因子(nerve growth factor，NGF)去除后感染性病毒粒子的产生。
2BoHV-5体外感染中miRNA的表达
在构建的BoHV-5体外潜伏感染再激活模型基础上，通过茎环引物反转录PCR(stem-loop RT-PCR)检测裂解感染、潜伏感染和再激活三种情况下BoHV-5编码的16种miRNAs的表达时序，并通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization， FISH)技术鉴定了miR-10-3p和miR-10-5p的存在。我们的结果表明BoHV-5在裂解感染和潜伏状态microRNAs的差异表达。
3miRNA-B10-3p在BoHV-5体外感染中的作用研究
最终将在裂解感染时读数最高并在潜伏期可检测到的miR-10-3p作为后续研究病毒miRNA在BoHV-5生命周期中作用的代表角色。我们使用细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome，BAC)重组方案将miRNA-B10-3p的靶位点UL39的3UTR产生7个碱基突变。结合实验室前期构建的miRNA-B10-3p致弱毒株，与野生型相比，突变株失去对靶基因调控表现为裂解感染期高拷贝DNA的复制，导致需要提高抗病毒药物使用量才能在体外建立潜伏期，潜伏期基因组表现出比野生型更强的活跃度和高效率的再激活。
总之，我们的试验结果表明，BoHV-5潜伏期的研究将从体外神经元培养模型中获益，并证明BoHV-5体外潜伏感染再激活模型有助于研究不同感染时期中miRNAs的表达。MiRNA-B10-3p对BoHV-5潜伏和再激活的影响揭示了独立于宿主对病毒基因组的沉默之外，病毒自身miRNA可以作为病毒在不同感染状态之间转换的开关之一。