论文部分内容阅读
纳豆激酶(NK),从传统食品纳豆中发现并提取而来。由于具有强烈纤溶活性和抗凝血活性,纳豆激酶被认为是一种潜在的预防和治疗心脑血管疾病的有效药物。 如何提高NK活性和稳定性,从而扩大其临床和商业的应用是目前该酶的研究热点。金属离子对于蛋白的结构和功能起着重要的作用,文献调研发现在研究金属离子对NK活性影响的过程中,通常加入高浓度(1-10mM)的金属离子。而高浓度的金属离子具有一定的毒性,例如影响蛋白质的结构,导致蛋白的聚集,甚至变性失活。传统的研究只针对金属离子对纳豆激酶活性和稳定性的影响,而对于影响产生的化学基础并未展开深入探究。 基于以上,本文利用光谱法通过研究金属离子与蛋白之间的相互作用来探究金属离子影响NK酶活性和稳定性的化学基础。 首先,利用紫外-可见吸收光谱法和荧光光谱法对NK与Tb3+、Co2+、Mn2+、Cu2+的结合性质进行了探究,利用共振光散射光谱表征了金属离子对NK聚集性质的影响。结果表明:Tb3+、Cu2+、Mn2+、Co2+能够与NK以化学计量比结合,并得到了相关的结合常数K;Tb3+与Ca2+在NK中的结合位点存在一定的竞争,并得到Ca2+与NK之间的结合常数;Cu2+与Tb3+在NK中的结合表现为相互抑制作用,即前者与NK结合后会抑制后者与酶的结合,而后者与酶结合会反过来削弱前者与NK的相互作用力;Tb3+、Ca2+、Na+对高浓度NK的聚集态具有明显的抑制效应,而高浓度的Cu2+、Co2+导致了NK的聚集。 其次,采用四肽底物法分别研究了高浓度和化学计量比的金属离子对NK活性的影响。通过酶促反应动力学测定的酶活性数据表明:NK酶促反应的最佳温度为310K,最佳酸碱度为pH=8;金属离子浓度不同对NK活性影响不同;化学计量比的金属离子,Tb3+和Ca2+对NK活性没有影响,Cu2+、Co2+、Mn2+对酶活性表现出不同程度的抑制;对于高浓度的金属离子,Tb3+和Ca2+对NK活性具有一定的提高,Cu2+、Co2+、Mn2+依然表现为抑制作用;初步探究了高浓度与化学计量比金属离子对NK活性的影响出现差异的原因,一是受金属离子本身性质的影响,二是金属离子影响了酶的聚集状态;NK活性受自身浓度的影响,一定浓度范围内,酶浓度越高,活性越大,一旦酶浓度达到使NK聚集的浓度,活性反而下降。 最后,通过化学变性剂诱导的蛋白质的解折叠来研究金属离子对NK稳定性的影响,并利用光谱和酶活性两种手段进行表征。结果表明:尿素和盐酸胍诱导的NK的解折叠服从单跃迁两态机理,根据光谱数据的非线性拟合以及由结构基元模型计算的热力学参数表明,金属离子的结合使得NK的稳定性增强;通过酶残余活性数据分析发现,金属离子结合前后的NK残余活性在不同浓度变性剂的影响下均经历从有到无的单跃迁两态过程,热力学参数吉布斯自由能变化不大,表明金属离子的结合对于NK活性部位的结构基元没有影响。 相对于传统的研究,本文的创新之处在于更细致的研究了金属离子对NK活性和稳定性影响的化学基础;筛选出了一些金属离子能显著改善NK易聚集的现象,对于扩大酶的实际应用具有重要的价值;采用化学变性的方法研究了NK的解折叠行为和稳定性,并将结构基元模型运用其中。