水稻是最重要的粮食作物,世界半数以上人口以水稻为主粮。水稻和其他作物一样在生长阶段受到生物及非生物逆境胁迫的影响。因为其较小的基因组,我们选择水稻作为研究对象在基因组水平上分析这些胁迫对水稻的影响。在大田生产中,盐和干旱胁迫是影响水稻等植物生长的两种主要非生物逆境。植物启动了多种分子、生理及生物学进程用以应对这些胁迫。研究发现,胞嘧啶(5mc) DNA甲基化作为一种主要的表观遗传学调控机制,在植物耐受胁迫过程中起重要的调控作用。植物通过基因表达水平的变化,改变其生理及发育机制,对这些环境胁迫做出响应,但其具体机理仍有待探索。为了探讨DNA甲基化在水稻非生物逆境中的调控机制,我们对盐和渗透两种胁迫下水稻全基因组水平的DNA甲基化进行分析,并通过高通量技术研究了差异基因表达(differential genes expression, DGE)和转录调控等。主要研究方法、试验结果和创新点等描述如下：以粳稻品种中花11为材料,首先研究了水稻中属于胞嘧啶DNA甲基转移酶(DNA-MTases)的MET (methyltransferease), CMT (chromomethyltransferase), DNMT2 (DNA methyltransferase 2)及DRM (domains rearranged methyltransferase)等四个亚家族10个基因(OsCMT1, OsCMT2, OsCMT3, OsDNMT2, OsMET1-1, OsMET1-2, OsDRM1a, OsDRM1b,OsDRM2,OsDRM3)的表达。DNA甲基转移酶不仅可以启动甲基化,同时也有维持甲基化水平的功能。组织表达分析结果表明,这些基因的表达差异较大,可能参与一些不同的基础代谢途径。它们的表达一般不受植物激素的调控,只有OsDRM1a和OsDRM1b两个基因的表达受到茉莉酸的下调调控。在盐及干旱胁迫下,这10个基因在水稻地上部、地下部的表达也有一定变异。进一步以粳稻日本晴和籼稻9311为材料,通过实时荧光定量PCR分析,发现这些基因的表达在籼、粳亚种问有差异显著。这些结果为进一步研究DNA甲基转移酶在调控水稻非生物逆境下的作用机制提供了基础。以粳稻品种中花11为材料,采用甲基化DNA免疫沉淀反应(MeDIP或mDIP)全基因组测序技术对水稻盐胁迫、渗透胁迫及对照组的基因组甲基化水平进行分析,发现对照组水稻基因组的甲基化水平要高于两种胁迫处理；使用甲基化特异PCR (MSP)、定量MSP及亚硫酸氢盐测序技术(BS-seq)等验证了MeDIP测序的结果。在对照组中获得的特有读取序列(Unique mapped reads)最多,达67,933,970(69.35%),盐胁迫和渗透胁迫中获得的特有读取序列分别64,858,665(66.21%)和65,173,609(66.53%)。对照组的特有读取序列多,表明其甲基化水平高,由此推测,在盐和渗透胁迫处理后,大量胁迫相关基因去甲基化,表达量提高以响应相应的胁迫处理。同时我们也发现,两种不同性质的胁迫在同一个基因组中导致了不同的表观遗传学变化调控。在对照组中发现的峰最多,达76,858,704,盐处理和PEG6000处理下的峰则分别只有75,321,706及75,163,830,两种胁迫之间的差异较小。将基因的基因组序列分为CpG岛、启动子区域(起始密码子上游2,000 bp)、 5-UTR.编码区、内含子区、3-UTR及下游2,000 bp等七个区间,对不同区间的甲基化水平分别进行测定。不同基因区域的读取序列分布代表了其基因组甲基化模式的特征。结果表明,启动子区的甲基化程度最高,对照43.14%,盐胁迫处理42.35%,渗透胁迫处理43.81%；其次是下游2,000 bp,对照34.76%,盐胁迫处理33.75%,渗透胁迫处理34.75%；编码区的甲基化程度更低一些,对照30.91%,盐胁迫处理30.17%,渗透胁迫处理33.10%。前人的研究发现,启动子区的高甲基化水平高度抑制基因的转录水平,本实验得到的结果与前人的是一致的。根据不同基因甲基化位置的不同,可以分为四组：启动子被修饰、基因区域被修饰、启动子和基因区域均被修饰、启动子和基因区域均未被修饰等。进一步对基因的甲基化数据和基因芯片数据在染色体上的分布进行分析,发现DNA甲基化水平和基因的表达水平之间存在负相关。总杂交信号中有72.95%的特异杂交信号,共对应33,000多个因为甲基化水平不同导致的差异表达基因。可能有多种基因家族和激素参与了胁迫应答过程,发现了一些重要的胁迫相关蛋白家族的转录因子,如ZFP、DUF、MYB、BURB、bZIP、F-Box、Coiled-coil domain、helix-loop-helix等,其中大部分转录因子之前未被报道过。通过定量PCR技术证实了这些基因在胁迫条件下的上调和下调表达变化,同时研究了其在根中及地上部中的不同处理时间段(Oh,3h,6h,12 h及24h)的表达变化,结果证明这些基因的表达变化对于相关胁迫响应有所不同。基因本体(Gene ontology, GO)富集分析及KEGG通路分析表明,大部分的GO分子功能、生物学过程及细胞学过程在甲基化程度上受到盐胁迫及渗透胁迫的影响。盐胁迫和对照比较中发现了53,841个差异表达基因,而渗透胁迫和对照比较中发现了16,670个差异表达基因。只有231个基因在两种胁迫(盐胁迫及渗透胁迫)下均有发现,归类在不同分子功能、生物学过程和细胞学过程。最后,我们研究了锌指蛋白家族在水稻非生物逆境胁迫应答中的作用,共鉴定到14个属于不同锌指蛋白亚家族(如GRF、SOZ11-C2H2、DOF、RING、SWIM、 LSD1、GATA及C3HC4)勺转录因子基因。根据其编码产物的预测蛋白质分子量将其分别命名为ZFP37、ZFP26、ZFP88、ZFP34、ZFP36、ZFP31、ZFP27、ZFP74、 ZFP160、ZFP55、ZFP57、ZFP96、ZFP45 及 ZFP35。14个基因中,有9个基因受到胁迫上调,5个受到两种胁迫的同时下调。这些基因分别定位在3、4、5、6、7、8、10、11及12号染色体上。通过半定量PCR技术及荧光定量PCR技术验证了这些新发现的基因,它们在胁迫样品中的表达变化与未处理对照样品中的表达变化有显著差异,说明其在胁迫调控中不可或缺。综上所述,本研究不仅揭示了胞嘧啶DNA甲基化在植物中是一种重要的表观遗传学调控手段,也为研究新发现基因的功能提供基础。超甲基化及去甲基化水平差异导致了靶基因在胁迫响应中的不同表达水平,这揭示了表观遗传学在减少作物受非生物逆境的影响,保护生长和产量不受损失方面有重要作用。