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本文采用乙烯基化和氧化还原聚合两步法包埋脂肪酶,从多方面考察包埋酶的水相和有机相催化性能,并将底物诱导技术与聚合包埋相结合,研究底物诱导对包埋酶催化活性的影响。
包埋脂肪酶的制备:①N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)作修饰剂,与酶表面的伯氨基反应完成乙烯基化。当脂肪酶与NAS的摩尔比约为1:114,反应时间为45min时获得最大程度的乙烯基化,其修饰度为94.8%。②单体:聚乙二醇200二甲基丙烯酸酯(A)、聚乙二醇200二丙烯酸酯(B)、聚乙二醇400二甲基丙烯酸酯(C)或聚乙二醇400二丙烯酸酯(D),在N,N,N′,N′-四甲基乙二胺/过硫酸铵引发下,对乙烯基化脂肪酶进行氧化还原聚合,得到四种包埋酶。脂肪酶与单体的配比是影响包埋效果的关键因素。实验证明,当脂肪酶液/单体=2.5/1(V:V)时包埋酶获得最大活性收率,并且四种包埋酶的蛋白负载率都超过96%。聚合反应的温度要控制在30℃,低温聚合保证了包埋酶的活性。
在考察包埋酶的水相催化性能时,四种包埋脂肪酶LIP-A、LIP-B、LIP-C和LIP-D的活性收率分别为29.8%、32.3%、39.2%和41.6%。由于酶与载体的多点共价连接,所以包埋酶的pH、热和储藏时间等稳定性都远远超过游离酶。在强酸(pH=2.4)、强碱(pH=11.5)和高温(80℃)环境中,游离酶几乎完全失活,但四种包埋酶的残余活力分别达到19.4%、42.0%和10%以上。用沉淀变性剂和溶解变性剂浸泡包埋酶30d,其残余活性仍分别保留在22.2%和17.5%以上。包埋酶经重复使用10次后仍残余83.2%以上的初始活力;置于4℃储藏60d之后,其残余活力为89.1%以上。
有机相中,包埋酶LIP-D的最佳催化温度是40℃。该温度下催化酯化反应在24h时达到平衡,此时LIP-D的酯化转化率为37.4%。水可以有效提高LIP-D的酯化活性,在含水量为2%(v/v)时,包埋酶的酯化转化率最高,其活性为无水体系的1.29倍。LIP-D包埋酶在循环使用5次后其活性损失仅有8.75%,表现出良好的稳定性。
采用月桂酸、正丁醇、椰油酰胺丙基甜菜碱(CAB35)、月桂基咪唑啉、月桂酸+CAB35和月桂酸+咪唑啉六种配体诱导包埋酶。六种底物诱导包埋酶的酶活较无底物诱导的包埋酶都有了不同程度的提高,其中尤以月桂酸+CAB35和月桂酸+咪唑啉两组双底物诱导的包埋酶的酶活提高最为显著,其活性收率分别为无底物诱导包埋酶活性的161.4%和237.3%。底物诱导还增强了包埋酶pH、热和储藏稳定性,并且不同的底物使包埋酶在不同方面的稳定性有所提高。月桂酸+CAB35诱导的包埋酶的pH稳定性最强:在强酸(pH=2.40)或强碱(pH=12.0)时,其残余活性分别为71.6%和72.1%。而在高温(100℃)和储藏60d时,月桂酸诱导的包埋酶最稳定,它的残余活力分别为39.7%和97.1%。