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海藻糖作为一种不具有还原性的双糖,有很好的保水性,能够在干燥条件下维持细胞膜的流动性。它还可以在高温条件下稳定酶蛋白、食品、化妆品和药物,维持细胞的生存,保护蛋白质在干燥和冷冻时不发生变性,由于特殊的性质,使它的商品化前景很可观。由于得到海藻糖的方法复杂,成本一直居高不下,严重影响了它的应用。为了能够得到更为简单、低成本生产海藻糖的工程菌以及方法,本研究以Bacillus cere us的p-淀粉酶和Pseudomonas putida 06的海藻糖合酶为出发点,利用分子生物学方法对两种基因进行拼接,得到了同时具有β-淀粉酶基因和海藻糖合酶基因的融合酶蛋白基因,并在E.coli BL21中得到了双功能融合蛋白。本研究首先通过PCR技术,分别以Bacillus cereus基因组DNA和Pseudomonas putida 06基因组DNA为模板进行克隆,得到了β-淀粉酶基因和海藻糖合酶基因,并成功构建了β-淀粉酶和海藻糖合酶重组质粒pET-28a-ba和pET-28a-ts,在E. coliBL21得到了重组酶蛋白。重组β-淀粉酶在pH6.47、45℃条件下,催化2%的直链淀粉12h后得到15.71g/L的麦芽糖,酶活力为12.11U/ml,麦芽糖产率78.5%。重组海藻糖合酶在pH7.4、45℃下,催化15%的麦芽糖溶液12h得到57.38g/L的海藻糖,酶活力为42.13U/ml,海藻糖产率38.9%。本研究采用了p-淀粉酶-海藻糖合酶和海藻糖合酶-p-淀粉酶两种连接顺序,以及LGSRSAEL、(GGGGS)2和(EAAAK)3作为连接肽,通过酶连法构建了6种融合酶,并且均在E.coli BL21中得到表达。重组融合蛋白大小约为120kDa,在LB培养基条件下进行,尽管SDS-PAGE显示6种融合蛋白都有表达,但重组融合酶中只有BAP3TS、TSP2BA和TSP3BA三种融合蛋白表现出了β-淀粉酶和海藻糖合酶双功能特性。本研究通过比较LB培养基与M9-ZJ培养基对融合酶重组菌的影响,认为M9-ZJ培养基更利于重组融合蛋白的表达。在M9-ZJ培养基的基础上,对成分进行了初步的单因素选择,经优化后培养基培养的6种融合酶重组菌所表达的融合酶蛋白均具有p-淀粉酶与海藻糖合酶双功能特性。其中融合酶BAP3TS对淀粉的催化效率最高,在pH7.0、45℃下催化6%的淀粉溶液最高可得到25.36g/L的海藻糖,酶活力为37.24U/ml,海藻糖产率42.27%。与LB培养基条件下得到的结果相比,海藻糖产量提高了大约11倍,与混合酶体系相比,海藻糖产量提高了2.5倍。