目的:骨髓抑制主要表现为外周血中白细胞降低,是化疗最常见的毒副反应之一,进而可引起身体机能状态下降、抵抗力减弱、严重感染等严重不良反应。根据我们前期已有的针灸抗骨髓抑制的研究基础,本研究以与骨髓造血细胞发育过程中影响造血干/祖细胞的生存、增殖和分化方向有关的Notch信号通路为切入点,探讨Notch信号通路上相关差异基因与针灸改善化疗后不良反应,保护骨髓造血细胞、改善骨髓抑制、增加外周血白细胞的相关作用途径及分子生物学机制;探讨针刺与艾灸两种疗法在改善骨髓抑制,提升白细胞方面作用环节的异同。同时这一研究也可为针灸改善造血损伤类疾病提供新的治疗方法和实验室依据。方法:选用清洁级,雄性昆明种(KM)小鼠40只,体重18±2g,小鼠在实验室中自由饲养3天后进行植瘤(温度20o~25oC,相对湿度60%左右)。在无菌操作台上进行操作,把所需物品放在无菌操作台上紫外线灯照射30min。抽取生理盐水13.8ml放入三角烧瓶中。左手持传代鼠,右手对小鼠腹部碘伏消毒,用1ml注射器(5ml针头)抽取腹水2.3ml,缓慢注入含13.8ml的生理盐水的三角烧瓶中,轻轻混匀,达到7倍稀释液。用1ml注射器(5ml针头)抽取细胞稀释液1ml,左手持鼠,右手先对40只小鼠左腋下碘伏消毒,再持注射器进行腋下注射,过程中针头先刺入皮下,再缓慢向左腋下方向推进,到达腋窝内再缓慢注入用瘤细胞5×106/0.2ml细胞稀释液,随后边推针边旋转针头至90°出针,同时用无菌棉签按压针孔数秒,避免液体渗出,最后放开小鼠,手持其尾部放入鼠笼中,完成植瘤。接种7天后,对荷瘤小鼠进行尾静脉采血并查WBC总数,挑选白细胞接近正常范围,瘤体生长良好的荷瘤小鼠32只(体质量22±2g、瘤体直径0.8cm左右),随机分为4组,8只/组,即荷瘤空白组,荷瘤模型组,荷瘤针刺组,荷瘤艾灸组;分笼饲养,苦味酸对各组荷瘤小鼠进行染色编号。荷瘤模型组,荷瘤针刺组,荷瘤艾灸组的小鼠1次性腹腔注射环磷酰胺(ctx)150mg/kg,停药后4h模型即成,荷瘤空白组小鼠腹腔注入同等剂量的生理盐水。各组荷瘤小鼠每次选取1只依次配对固定于自制鼠板上施以针刺和艾灸治疗。荷瘤空白组,荷瘤模型组陪同固定不治疗;荷瘤针刺组选取“大椎”、“膈俞”(双)、“肾俞”(双)、“足三里”(双)选用江苏无锡佳健牌美容毫针(规格:0.19cm×10mm,针柄20mm),采用管式进针法直刺,进针深度为3mm,留针6min。每日1次,连续5天;荷瘤艾灸组选取“大椎”、“膈俞”(双)、“肾俞”(双)、“足三里”(双)选用特制美容艾条(规格:0.4cm×25cm)点燃后,高于荷瘤小鼠穴位皮肤2cm处固定每穴悬灸3min,每日1次,连续5天。荷瘤空白组,荷瘤模型组同步固定,但不予治疗。从荷瘤小鼠注射ctx之前一直到治疗5天后,每天早上定时、按编号顺序将每只小鼠割尾静脉采血,光学显微镜下检测外周血白细胞计数,治疗5天后的第2天在干冰上取荷瘤小鼠双侧股骨和胫骨。课题组前期应用小通量基因表达谱芯片初步筛选各组健康小鼠骨髓造血细胞中notch信号通路相关差异基因;由于一方面健康小鼠与荷瘤小鼠为同一批次,只是带瘤体质的不同,另一方面由于经费原因,故在前期筛选的基础上,运用免疫组化法对进一步筛选不同组别荷瘤小鼠骨髓造血细胞中notch信号通路相关差异基因蛋白表达情况;realtime-pcr法分析不同组别荷瘤小鼠骨髓造血细胞中notch信号通路相关差异基因mrna的转录情况;western–blot法进一步验证不同组别荷瘤小鼠骨髓造血细胞中notch信号通路相关差异基因的蛋白表达量。阐释调控ctx化疗荷瘤小鼠骨髓细胞中的notch信号通路是针灸减轻骨髓抑制、提升外周血白细胞等综合作用的关键机制。结果:(1)“实验一”结果显示,荷瘤小鼠从注射ctx后的第2天外周血白细胞即降低。与荷瘤空白组比,治疗后第3天荷瘤模型组、荷瘤针刺组、荷瘤艾灸组白细胞计数降至最低(p<0.05),治疗后第4天开始回升,与荷瘤模型组比,荷瘤针刺组、荷瘤艾灸组白细胞数回升幅度较大。治疗后第5天,荷瘤模型组、荷瘤针刺组、荷瘤艾灸组白细胞数均已接近基础白细胞水平,且与荷瘤针刺组、荷瘤艾灸组白细胞数高于荷瘤模型组,但差异无统计学意义(p>0.05)。(2)“实验二”结果显示,通过小通量基因表达谱芯片对健康小鼠进行初步筛选,由于考虑小鼠来至同一整体,只是带瘤体质不同,故没有对荷瘤小鼠进行再次筛选,把筛选出的七个差异基因:notch1、notch2、jag1、jag2、delta1、numb1、numb2同样作为差异基因进行下一步研究。(3)“实验三”结果显示,运用免疫组化法对小通量基因表达谱芯片初步筛选出的荷瘤小鼠骨髓造血细胞notch信号通路相关差异基因进行进一步筛选,与荷瘤空白组比,荷瘤模型组中notch2和jag1、jag2蛋白表达含量降低,numb1和numb2蛋白表达含量升高,且具有显著性差异(p<0.05);delta1、notch1差异无统计学意义(p>0.05);与荷瘤模型组比,荷瘤针刺组与荷瘤艾灸组中notch2和jag1蛋白表达含量降低,numb1和numb2蛋白表达含量升高,且具有显著性差异(p<0.05);delta1、notch1、jag2差异无统计学意义(p>0.05)。故最后确定将具有显著性差异的jag1、notch2、numb1、numb2基因进一步进行研究。(4)“实验四”结果显示,运用rt-pcr法对荷瘤小鼠骨髓造血细胞notch信号通路中显著性差异基因jag1、notch2、numb1、numb2的mrna转录情况进行检测。与荷瘤空白组比,荷瘤模型组jag1、notch2蛋白表达含量升高但差异无统计学意义(p>0.05),numb1、numb2蛋白表达含量降低,且numb2具有显著性差异(p<0.05);与荷瘤模型组比,荷瘤针刺组、荷瘤艾灸组jag1、notch2蛋白表达含量均有升高,numb1蛋白表达含量降低,但均无统计学差异(p>0.05);与荷瘤模型组比,荷瘤艾灸组numb2蛋白表达含量升高,具有显著性差异(p<0.05);与荷瘤针刺组比,荷瘤艾灸组numb2蛋白表达含量高于荷瘤针刺组,但差异无统计学意义(p>0.05)。(5)“实验五”结果显示,运用western-blot法对荷瘤小鼠骨髓造血细胞notch信号通路中显著性差异基因jag1、notch2、numb1、numb2的蛋白表达情况进行检测。与荷瘤空白组比,荷瘤模型组jag1、notch2蛋白表达含量升高且有显著性差异(p<0.05),numb1、numb2蛋白表达含量降低,但差异无统计学意义(p>0.05);与荷瘤模型组比,荷瘤针刺组、荷瘤艾灸组jag1、notch2蛋白表达含量均降低,且具有显著性差异(p<0.05),numb1、numb2蛋白表达含量升高,但差异无统计学意义(p>0.05);与荷瘤针刺组比,荷瘤艾灸组jag1、notch2蛋白表达含量均降低,numb1、numb2蛋白表达含量升高,差异虽无统计学意义(p>0.05),但针刺有优于艾灸的趋势。结论:1.荷瘤小鼠白细胞基数比健康小鼠稍高。2.针刺和艾灸可以减轻ctx化疗所致荷瘤小鼠骨髓抑制,提升外周血白细胞,其疗效确切与导师组前期研究结果一致,治疗后第3天降至最低,第4天开始回升,第5天达到正常,且荷瘤针刺组、荷瘤艾灸组白细胞数高于荷瘤模型组,针刺和艾灸两种方法没有显著性差异。3.课题组前期应用小通量基因表达谱芯片初步筛选各组正常小鼠骨髓造血细胞中notch信号通路相关差异基因;共筛选出七个差异基因:notch1、notch2、jag1、jag2、delta1、numb1、numb2。通过免疫组化法对小通量基因表达谱芯片初步筛选出的荷瘤小鼠骨髓造血细胞notch信号通路7个差异基因进一步筛选,确定jag1、notch2、numb1、numb2基因具有显著性差异。4.通过对上述指标的变化规律及相关性分析,阐释针灸保护荷瘤小鼠骨髓造血细胞,减轻骨髓抑制,提升白细胞数量与骨髓造血细胞notch信号通路相关基因和蛋白的分布及表达的关系,其关键机制可能是:对于ctx化疗所致骨髓抑制,针灸可以通过上调荷瘤小鼠骨髓细胞中notch信号通路上numb蛋白(numb1、numb2)的表达,同时下调notch2、jagged1的蛋白表达,进而抑制过度激活的notch信号通路,减轻因ctx化疗引起的骨髓抑制。验证了“notch信号通路是针灸对抗骨髓抑制、改善造血等综合作用的关键机制”之假说。