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研究背景:尽早开通阻塞血管,重建血流,挽救缺血半暗带是急性缺血性卒中治疗的关键。但缺血/再灌注损伤的存在,使真实世界中血管再通治疗人群的获益受到了一定限制,尽管对再灌注损伤机制进行了多方面基础与临床研究,但其确切分子机制尚不明确,这限制了相关药物防治策略的实施。激活素A（Activin A,Act A）是转化生长因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）超家族成员之一,具有抗缺血性损伤、促进神经修复的功能。课题组前期对其神经保护和相关机制进行了研究,证实Act A能够减少氧糖剥夺诱导的PC12细胞发生凋亡,其机制可能与Act A/Smads信号激活,降低炎症因子水平并增加抗氧化酶SOD的活性有关。铁死亡是一种铁依赖性的以脂质过氧化蓄积为特点的程序性细胞死亡方式,已被证实参与了缺血性卒中及缺血/再灌注损伤的发生发展。研究表明Act A I型受体通过调控核因子E2相关因2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2）参与Erastin诱导的HK-2人肾小管上皮细胞铁死亡,但Act A及其通路是否参与神经细胞铁死亡及是否通过调控铁死亡参与脑缺血/再灌注损伤的发生发展尚不明确。本课题在前期研究基础上,以小鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）和HT22细胞氧糖剥夺/复糖复氧oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)建立脑缺血再灌注/损伤模型,Erastin诱导建立神经细胞铁死亡模型,检测细胞铁、脂质过氧化水平,采用Western blot、实时荧光定量PCR等技术测定铁死亡关键蛋白及基因的表达,通过外源性Act A干预,阐明Act A对脑缺血再灌注/损伤的作用、对铁死亡的影响及Act A通过铁死亡调控脑缺血再灌注/损伤的分子机制,为脑缺血/再灌注损伤的治疗提供理论依据及新的靶点。本研究包括以下内容:1.Act A对小鼠脑缺血/再灌注损伤的作用及对铁死亡的影响目的:明确Act A对小鼠脑缺血/再灌注损伤的作用,探索Act A对铁死亡关键指标的影响及可能的通路蛋白。方法:选取C57BL/6雄性小鼠24只,分为载体假手术（sham）组,Act A假手术组,载体MCAO组,Act A给药MCAO组,共4组。应用线栓法建立小鼠MCAO/再灌注模型,采用Bederson评分方法评价神经功能缺损,TTC染色分析脑梗死体积,ELISA法测定丙二醛（MDA）含量检测脂质过氧化,铁试剂盒检测组织铁含量,Western-Blot检测铁死亡标志蛋白GPX4、ACSL4及可能的通路蛋白Nrf2的表达水平。结果:与载体MCAO组相比,Act A给药MCAO组小鼠的神经功能缺损评分明显降低,脑梗死体积明显缩小（P＜0.05）;与载体假手术组相比,载体MCAO组铁含量、脂质过氧化MDA水平明显升高,铁死亡标志蛋白GPX4表达明显降低,ACSL4表达明显升高（P＜0.01）;与载体MCAO组小鼠相比,Act A组MCAO小鼠脑组织铁含量、MDA水平明显降低,GPX4蛋白表达明显升高,ACSL4蛋白表达明显降低（P＜0.01）;与载体sham组相比,载体MCAO组Nrf2蛋白表达明显升高（P＜0.01）;而与载体MCAO组小鼠相比,Act A组MCAO小鼠Nrf2蛋白表达进一步升高（P＜0.05）。结论:Act A对脑缺血再灌注损伤具有保护作用,外源性给予Act A可以降低神经功能缺损评分,缩小梗死体积;Act A可以减轻脑缺血再灌注损伤引起的脑组织铁超载、脂质过氧化水平增加、ACSL4蛋白表达升高及GPX4表达降低等铁死亡关键事件;Act A在保护小鼠MCAO/再灌注损伤的同时显著上调Nrf2蛋白表达。2.Act A通过抑制铁死亡发挥对HT22细胞OGD/R损伤的保护作用目的:明确Act A对HT22神经细胞OGD/R损伤的作用及对铁死亡的影响;阐明Act A抑制神经细胞铁死亡及可能的机制;进一步印证Act A通过抑制铁死亡发挥对神经细胞OGD/R损伤的保护作用。方法:选取小鼠海马神经元HT22细胞系,通过更换无糖培养基、三气培养箱低氧法（94%N2、5%CO2、1%O2）OGD 3h后复糖复氧24h建立OGD/R模型,CCK-8法测定细胞活力、LDH测定细胞损伤,检测铁死亡相关指标。通过Erastin诱导HT22细胞构建神经细胞铁死亡模型,外源性给予Act A,检测细胞铁、脂质过氧化水平,Western-blot检测铁死亡标志蛋白,实时荧光定量PCR检测铁死亡关键基因的表达。检测Act A抑制铁死亡可能的通路蛋白Nrf2的变化。结果:在OGD/R模型中,结果显示:与对照组相比,OGD/R造模组细胞存活率明显降低,细胞损伤LDH明显升高（P＜0.01）,提示OGD/R造模成功。与OGD/R造模组相比,OGD/R前+Act A及OGD/R后+Act A组细胞活力均明显升高（P＜0.01）;且OGD前给予Act A预处理较OGD后给予Act A进一步提高了细胞存活（P＜0.01）;与OGD/R造模组相比,OGD/R前+Act A及OGD/R后+Act A组细胞LDH、铁含量、ACSL4蛋白表达均明显降低、GPX4蛋白、SLC7A11表达均显著升高（P＜0.01）,OGD/R前+Act A组MDA含量明显降低（P＜0.01）。Erastin诱导HT22细胞铁死亡的最适浓度为10μM,最适作用时间为8h;与对照组相比,Erastin处理组细胞LDH水平、铁含量明显升高（P＜0.01）,铁死亡标志蛋白GPX4表达降低,ACSL4表达升高,铁死亡关键基因SLC7A11 m RNA表达降低（P＜0.01）,提示铁死亡造模成功。与单纯Erastin造模组比较,Act A干预组铁含量降低、脂质过氧化MDA水平降低、ACSL4蛋白表达降低、GPX4表达升高（P＜0.01）,SLC7A11 m RNA表达升高（P＜0.05）;与对照组相比,Erastin造模组Nrf2蛋白表达升高（P＜0.01）;与单纯Erastin造模组比较,Act A干预组Nrf2蛋白表达进一步升高（P＜0.01）。在铁死亡干预实验中,OGD/R前给予铁死亡诱导剂Erastin预处理,细胞存活率降低（P＜0.01）;OGD/R前给予Act A预处理细胞存活率升高（P＜0.01）;给予Act A同时予Erastin干预,细胞存活率降低（P＜0.05）。OGD/R前给予铁死亡诱导剂Erastin,ACSL4表达升高,GPX4表达降低（P＜0.01）;OGD/R前给予Act A,ACSL4表达明显降低,GPX4表达显著升高（P＜0.01）;给予Act A同时予Erastin干预较单纯Act A干预组细胞ACSL4表达升高,GPX4表达降低（P＜0.01）。结论:Act A对HT22神经细胞OGD/R损伤具有保护作用;Act A可以抑制Erastin诱导的神经细胞铁超载、脂质过氧化、ACSL4表达升高及GPX4、SLC7A11表达降低等铁死亡关键事件,且能够促进神经细胞铁死亡时Nrf2的表达;Act A对神经细胞缺血/再灌注损伤（OGD/R）的保护作用是通过抑制铁死亡发挥。3.Act A通过上调Nrf2抑制HT22细胞OGD/R铁死亡目的:进一步阐明Act A通过抑制铁死亡保护神经细胞OGD/R损伤的分子机制。方法:建立HT22细胞系OGD/R模型,造模后予Act A及Nrf2抑制剂干预,实验分组为空白对照组、OGD/R造模组,OGD/R+Act A组、OGD/R+Act A+Nrf2抑制剂（ML385）组。Act A浓度为100ng/ml,于造模前12小时加入,ML385浓度为5μM,与Act A同时加入。CCK-8法测定细胞活力、LDH测定细胞损伤,ELISA法检测细胞铁、脂质过氧化水平MDA含量,Western-blot检测铁死亡标志蛋白ACSL4及GPX4的表达。结果:复糖复氧24小时后,检测相关指标,结果显示与OGD/R Act A干预组相比,同时给予Nrf2抑制剂ML385可使细胞活力明显降低（P＜0.01）;LDH水平、细胞铁含量明显升高（P＜0.01）;脂质过氧化MDA水平升高（P＜0.05）;铁死亡标志蛋白ACSL4表达明显升高,GPX4表达明显降低（P＜0.01）。结论:Act A通过上调Nrf2表达抑制HT22细胞OGD/R铁死亡,对神经元OGD/R损伤起保护作用。