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第一部分临床白色念珠菌抗真菌药物敏感性和MLST分型研究目的:监测江西地区白色念珠菌对临床常用抗真菌药物敏感性,为临床白色念珠菌感染的合理用药提供流行病学依据。对白色念珠菌进行MLST分型研究,分析其流行进化关系,查找本地区临床白色念珠菌优势菌株。方法:1.分离和纯化临床菌株,利用CHROMagar显色培养和多重PCR快速鉴定法鉴定白色念珠菌;2.按照美国临床试验标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的《酵母微量稀释抗真菌药物敏感性试验参考方法第三版》(M27-A3)检测白色念珠菌对两性霉素B(Amphotericin B,AMP B)、5-氟胞嘧啶(5-Flucytosine,5-FC)、氟康唑(Fluconazole,FCZ)、伊曲康唑(Itraconazole,ICZ)和酮康唑(Ketoconazole,KETO)等5种临床常见抗真菌药物的敏感性;3.利用基于DNA测序的多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)方法对白色念珠菌进行基因分型;4.使用MEGA6.0对MLST分型中出现的核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism,SNP)进行分析,采用非加权组算数平均法(Unweighted Pair Group Method With Arithmetic Mean,UPGMA)获得最小生成树,并以遗传距离(p-distances)0.04为截断值,分析白色念珠菌流行进化关系。结果:1.本研究通过分离、纯化和鉴定,共获得185株白色念珠菌临床分离株;2.185株白色念珠菌主要来源于痰(103株,55.7%)、阴道或宫颈分泌物(66株,35.7%)和尿液(10,5.4%);3.白色念珠菌对AMP B、5-FC、FCZ、ICZ和KETO耐药率分别为0.0%、2.7%、7.0%、5.4%和2.7%;4.MLST基因分型共获得122个双倍体序列型(double sequence type,DST),其中DST2889~DST2899和DST2945~DST3032共99个为新发现DST,并已被Pub MLST数据库收录;5.MLST分型的7个管家基因片段核苷酸序列共2883bp,其中发现SNP有86个(3.1%)。片段AAT1a、AAC1、ADP1、MPIb、SYA1、VPS13和ZWF1b分别发现SNP位点7个(7/373,1.9%)、10个(10/407,2.5%)、16个(16/443,3.6%)、16个(16/375,4.3%)、9个(9/391,2.3%)、16个(16/403,4.0%)和16个(16/491,3.3%);6.聚类分析发现,白色念珠菌分为12个进化分支(n≥5),其中Clade 1含菌株数最多(56株,30.3%),其次分别是Clade 2(17株,9.2%)、Clade 3(16株,8.6%)、Clade 4(14株,7.6%)。结论:1.185株白色念珠菌抗真菌药物敏感性与当前国内其他地区研究结果基本一致;2.本地区白色念珠菌临床菌株之间有明显的遗传变异,122个双倍体序列型中有99个是本研究新发现的,这些新发现的DST已被白色念珠菌MLST数据库收录;3.聚类分析发现白色念珠菌分为12个进化分支,Clade 1菌株数量最多,是本地区白色念珠菌感染的优势菌群。第二部分白色念珠菌Ca Htr Ap丝氨酸蛋白酶功能初探目的:阐明白色念珠菌Ca Htr A蛋白(high-temperature requirement A protein,Ca Htr Ap)丝氨酸蛋白酶功能,并检测水解活性丝氨酸残基对其功能的影响。筛选与Ca Htr Ap相互作用的白色念珠菌蛋白,为进一步研究Ca Htr Ap功能及其在白色念珠菌致病过程中的作用奠定基础。方法:1.使用NCBI Conserved domain prediction在线工具分析Ca Htr Ap保守结构域;2.使用Psort II在线工具分析Ca Htr Ap前导序列,并预测其亚细胞定位;3.使用软件Clustal X1.86比对分析Ca Htr Ap结构域及其同源蛋白氨基酸序列;4.利用PCR技术扩增出Ca Htr Ap N端功能Deg Q结构域(定义为Ca Htr A1p)基因,将其定向克隆至原核表达质粒p ET-28c中,构建成重组质粒p ET28c-Htr A1;利用overlap PCR原理将Ca Htr A1p丝氨酸残基Ser219和Ser220突变成Cys或Ala,构建成重组质粒p ET28c-Htr A1S219A、p ET28c-Htr A1S219C、p ET28c-Htr A1S220A、p ET28c-Htr A1S220C和p ET28c-Htr A1S219/220A;重组表达质粒使用菌液PCR、双酶切鉴定和DNA测序进行确认;5.使用半乳糖苷类似物IPTG诱导重组质粒表达,使用超声波破碎细胞壁后收集总蛋白,并利用镍离子亲和层析纯化融合蛋白;6.利用体外酶活性检测反应,检测Ca Htr A1p及其活性丝氨酸残基突变体蛋白降解丝氨酸蛋白酶特异性底物β-casein活性,验证Ca Htr A1p丝氨酸蛋白酶功能,以及Ser219和Ser220对其蛋白酶活性的影响;7.通过使用融合蛋白Ca Htr A1p免疫Babl/c小鼠制备抗Ca Htr A1p多克隆抗体;8.利用免疫荧光技术,验证Ca Htr Ap亚细胞定位;9.使用体外免疫共沉淀技术和质谱分析,筛选与Ca Htr Ap相互作用的白色念珠菌蛋白。质谱分析阳性标准:唯一匹配肽段计数(Unique Pep Count)≥2。结果:1.保守结构域分析发现,Ca Htr Ap为双Deg Q结构域蛋白,由2个丝氨酸蛋白酶结构域和4个PDZ结构域组成;N端Deg Q结构域有胰酶样丝氨酸蛋白酶保守的―催化三分子(catalytic triad)‖(His105-Asp136-Ser220)基序(motif);2.Psort II分析结果表明,Ca Htr Ap没有N端前导序列,也没有核定位信号,被预测为胞质蛋白;3.氨基酸序列比对发现,Ca Htr Ap N端Deg Q具有催化三分子,预测的活性丝氨酸残基Ser220附近有保守序列GSSGS,Ser219为Ser220邻近丝氨酸;而C端Deg Q结构域功能缺失;4.菌液PCR、双酶切鉴定和DNA测序结果表明,重组原核表达质粒p ET28c-Htr A1、p ET28c-Htr A1S219A、p ET28c-Htr A1S219C、p ET28c-Htr A1S220A、p ET28c-Htr A1S220C和p ET28c-Htr A1S219/220A构建成功;5.体外诱导表达、纯化和浓缩融合蛋白,融合蛋白Ca Htr A1p、Ca Htr A1S219Ap、Ca Htr A1S219Cp、Ca Htr A1S220Ap、Ca Htr A1S220Cp和Ca Htr A1S219A/S220Ap定量浓度分别为2.4 mg/m L、1.84 mg/m L、2.00 mg/m L、1.52 mg/m L、1.45mg/m L和1.90 mg/m L;6.体外蛋白酶活性验证结果表明,Ca Htr A1p能够降解底物β-casein,具有丝氨酸蛋白酶活性;在酶活性反应中,实验组Ca Htr A1p、Ca Htr A1S219Cp、Ca Htr A1S220Cp、Ca Htr A1S220Ap、Ca Htr A1S219A/S220Ap和Ca Htr A1S219Ap对底物β-casein的降解效率分别为0.84、0.74、0.66、0.46、0.42和0.35;7.Ca Htr Ap免疫荧光结果表明:Ca Htr Ap定位于细胞质,可能在细胞膜附近起作用;荧光半定量分析发现假菌丝细胞Ca Htr Ap表达水平显著高于酵母相细胞(单位细胞面积光密度值0.23 vs.0.15,p=0.002);8.免疫共沉淀技术和质谱分析共筛选出8个与Ca Htr Ap相互作用蛋白,包括3个核糖体亚基蛋白(RPL3、RPS9B和RPS3)以及延伸因子1(elongation factor1-alpha,TEF1)、肌动蛋白(actin 1,ACT1)、泛醇色素C还原酶亚基2(ubiquinol-cytochrome c reductase core subunit 2,QCR2)、细胞色素P450(cytochrome P450,TRI4)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(dihydrolipoamide dehydrogenase 1,LPD1)。结论:1.Ca Htr A1p具有胰酶样丝氨酸蛋白酶结构域和典型的丝氨酸蛋白酶活性;2.Ser219和Ser220都对Ca Htr A1p蛋白酶活性有重要影响,而且两者之间存在协同效应;3.Ca Htr Ap是一种细胞质蛋白,可能与假菌丝形成有关;4.本研究筛选出与Ca Htr Ap相互作用的白色念珠菌蛋白8个,包括TEF1、ACT1、QCR2、TRI4、LPD1、RPL3、RPS9B和RPS3。