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本研究通过分析目标物功夫菊酯与异氰戊菊酯的结构与组成,设计了针对功夫菊酯与异氰戊菊酯的特异性半抗原分子,得到了3种(Cwb-6,Dwb-5,N-4)不同结构的功夫菊酯半抗原与2种(Qa,Qc)不同结构的异氰戊菊酯半抗原,并对它们的结构进行了鉴定。将这5种半抗原分子以及异氰戊菊酸分子与载体蛋白偶联制备出完全抗原,通过电泳法估测了完全抗原的偶联比。
将合成得到的5种半抗原分子与载体蛋白BSA的偶联物免疫新西兰长耳白兔,得到8个功夫菊酯抗血清与4个异氰戊菊酯抗血清；经过抗血清与包被抗原的亲和力实验以及加入目标分析物标准品的竞争抑制实验,选定Cwb-C与Cwb-6-OVA的组合作为检测功夫菊酯免疫分析的抗血清与包被原的组合；在异氰戊菊酯的免疫分析方法建立中选定Qc-B与异氰戊菊酸-OVA作为异氰戊菊酯的免疫分析的抗血清与包被原的组合。
使用选定的抗血清与包被抗原的组合开展了抗血清、包被抗原与酶标记二抗的具体工作浓度研究,功夫菊酯ELISA分析的抗血清、包被抗原与酶标二抗的工作浓度(以稀释度表示)分别为1:4000、1:1000和1:1000,异氰戊菊酯ELISA分析的抗血清、包被抗原与酶标二抗的工作浓度(以稀释度表示)分别为1:2000、1:1000和1:1000。
通过竞争抑制实验确立了功夫菊酯与异氰戊菊酯的ELISA分析标准曲线,回归分析结果为:功夫菊酯的ELISA回归方程为Y=-0.448X+1.201[R2=0.993),其中抑制中浓度IC50=37.15μg/L,最低检测限IC15=4.72μg/L；异氰戊菊酯ELISA回归方程为Y=-0.30X+1.71(R2=0.9801),抑制中浓度IC50==10715μg/L,最低检测限IC20=1012μg//L。
对功夫菊酯的ELISA分析方法进行了交叉反应实验,结果显示,测试的多数合成菊酯类农药(氰戊菊酯、溴氰菊酯、氟胺氰菊酯)在浓度为0.1～10,000μg/L范围内均与功夫菊酯没有明显的交叉反应,其中甲氰菊酯(ICR=0.03％)与氯氰菊酯(CR=2.5％)有较小的交叉反应。
在功夫菊酯ELISA分析的样品稀释液中加入不同浓度的NaCl、甲醇或丙酮,或者改变样品稀释液的pH值从而评价盐离子浓度、有机溶剂以及pH值对于功夫菊酯ELISA分析方法的影响。从结果可以看出随着盐离子浓度升高,抗原抗体亲和力减弱,0孔OD值下降；同时,由于反应体系中一些非特异性抗体的结合减少,检测的灵敏度增加。当pH值为3～8时,ELISA检测的灵敏度变化不大,超出这一范围的pH值对于ELISA分析的灵敏度影响较大。由于功夫菊酯属于弱极性物质,在水中的溶解度较小,水溶液中的功夫菊酯通常附着到容器的表面,从而降低了检测的灵敏度。在添加甲醇与丙酮到样品稀释液中后,提高了功夫菊酯的溶解度,同时也提高了检测的灵敏度,但是过量的有机溶剂会影响抗原抗体的结合反应,甚至使抗体蛋白变性。
由于功夫菊酯对于水生生物的毒害作用较大,使用本研究建立的功夫菊酯ELISA分析方法应用到3种不同来源水样中的功夫菊酯残留的检测分析。为了降低水样本身特性(盐离子浓度、pH值以及有机杂质)对于ELISA分析方法的影响,本研究通过筛选6种预处理方法,针对不同的水样选定不同的预处理方法得到较好的回收率结果。同时为了能够检测水样中亚μg/L级的功夫菊酯的残留,本实验应用了一个快速有效的固相萃取过程,提取并富集水样中人为添加的功夫菊酯,不同水样的回收率平均值均在90％～112％之间。以上的水样中功夫菊酯添加回收实验结果显示经过预处理或固相萃取过程,水样中的离子与其他杂质对于检测分析的影响基本被消除。检测范围可达0.1～2,500μg/L,回收率在81～112％之间.